Name: spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00
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El autor desea agradecer a Karoline Dittmer y Andrew Brittingham por sus ideas y muchas discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Fondo de Educación e Investigación Osteopática de Iowa (IOER 03-17-05 y 03-20-04).

1. Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa
<ol><li>Preparar soluciones madre de los reactivos necesarios como se indica en la Tabla 1 (antes del día experimental).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td colspan="2">Indicaciones</td>
		</tr><tr><td>50 mM Tris pH 8.0</td>
			<td colspan="2">Disuelva 0,61 g de base de Tris en ~ 80 ml de agua.  Enfriar a 4 ?...

<ol>
	<li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria.">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li><li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists.">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li><li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism.">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li><li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase,+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose.">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li><li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li><li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases.">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li><li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase.">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li><li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1,6-glucosidase.">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li><li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose.">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li><li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis.">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li><li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases.">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li><li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues.">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li><li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates.">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li><li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,+6-diphosphatase,+phosphofructokinase,+glycogen+synthetase,+phosphorylase,+and+protein+kinase+from+swine+kidney.">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li><li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis.">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).</li><li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li><li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification,+properties+and+physiological+role.">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li><li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain:+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain.">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li><li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).</li><li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+of+amylose+and+iodine.">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li><li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1,4,-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltansferase.">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine.">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li><li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence.">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li><li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate.">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li><li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties.">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li><li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation.">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li><li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases.">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li><li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis:+An+unusual+member+of+the+starch/glycogen+synthase+family.">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li><li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-1,4-glucan:+alpha-1,4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver.">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li><li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+oyster+glucogen.">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li><li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis.">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li></ol>

En general, las ventajas clave de todos los métodos presentados son su bajo costo, facilidad, velocidad y falta de dependencia de equipos especializados. La principal desventaja que todos comparten es la sensibilidad en comparación con otros métodos disponibles. La sensibilidad de los procedimientos que implican la producción o el consumo de NADH/NADPH es fácil de estimar. Dado que el coeficiente de extinción de NADH/NADPH es 6.22 M-1 cm-1 , la aritmética simple indica que ~ 10-20 μM cambios...

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre 1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metabolismo del glucógeno requiere estudiar las enzimas clave de la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa y la enzima ramificante) y la degradación del glucógeno (glucógeno fosforilasa y enzima desramificante). Los ensayos estándar de oro de glucógeno sintasa, fosforilasa, ramificación y actividades enzimáticas de desramificación emplean isótopos radiactivos. Por ejemplo, la glucógeno sintasa se mide generalmente en un ensayo radioquímico detenido siguiendo la incorporación de glucosa de UDP-[14 C]glucosa (en el caso de enzimas animales y fúngicas) o ADP-[14C]glucosa (en el caso de enzimas bacterianas) en glucógeno 4,5. Del mismo modo, la glucógeno fosforilasa se mide en la dirección de la síntesis de glucógeno, después de la incorporación de glucosa de [14C] glucosa-1-fosfato en glucógeno6. La enzima de ramificación se ensaya midiendo la capacidad de esta enzima para estimular la incorporación de [14 C]glucosa de glucosa-1-fosfato en cadenas ligadas a α1,4 por la glucógeno fosforilasa7, y la actividad enzimática de desramificación se determina siguiendo la capacidad de la enzima para incorporar [14C]glucosa en glucógeno8 . Si bien son muy sensibles, lo que permite su uso en extractos de células crudas con bajos niveles de actividad enzimática, los sustratos radiactivos son caros y están sujetos a los requisitos reglamentarios relacionados con el uso de radioisótopos. Estas barreras ponen el uso de ciertos ensayos fuera del alcance de muchos trabajadores. Sin embargo, a lo largo de muchos años, se ha descrito una impresionante variedad de enfoques espectrofotométricos para la medición de estas enzimas. En general, estos enfoques se basan en última instancia en la medición de la producción o el consumo de NADH / NADPH, o la generación de complejos coloreados entre el glucógeno y el yodo. Por lo tanto, son sencillos y se pueden llevar a cabo utilizando espectrofotómetros simples equipados solo con lámparas de flash de tungsteno o xenón.
Los ensayos espectrofotométricos de glucógeno sintasa se basan en la medición del nucleósido difosfato liberado por el donante de nucleótido de azúcar a medida que la glucosa se agrega a la creciente cadena de glucógeno 9,10. El procedimiento para medir la actividad de la glucógeno sintasa descrito en la sección 1 del protocolo, a continuación, es una modificación de la descrita por Wayllace et al.11, y el esquema de acoplamiento se muestra a continuación:
(Glucosa) n + UPD-glucosa → (glucosa)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD+
La glucógeno sintasa agrega glucosa de UDP-glucosa al glucógeno. El UDP generado en este proceso se convierte en UTP por nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa), en una reacción que genera ADP. El ADP, a su vez, sirve como sustrato para la piruvato quinasa, que fosforila el ADP utilizando fosfoenolpiruvato como donante de fosfato. El piruvato resultante se convierte en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa en una reacción que consume NADH. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar de manera continua, monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume NADH. Se adapta fácilmente para su uso con enzimas que requieren ADP-glucosa como donante de glucosa. Aquí, los pasos de acoplamiento son más simples ya que el ADP liberado por la acción de la glucógeno sintasa es directamente actuado por la piruvato quinasa.
Hay una variedad de ensayos espectrofotométricos disponibles para la determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa. En la versión clásica, la enzima es impulsada hacia atrás, en la dirección de la síntesis de glucógeno, como se muestra a continuación:
(Glucosa) n + Glucosa-1-fosfato → (Glucosa)n+1 + Pi
A intervalos de tiempo, se eliminan las alícuotas de la mezcla de reacción y se cuantifica la cantidad de fosfato liberado12,13. En nuestras manos, este ensayo ha sido de uso limitado debido a la presencia de fosfato libre fácilmente medible en muchas preparaciones comerciales de glucosa-1-fosfato, combinado con las altas concentraciones de glucosa-1-fosfato requeridas para la acción de la fosforilasa. Más bien, hemos empleado rutinariamente un ensayo alternativo que mide la glucosa-1-fosfato liberada a medida que el glucógeno es degradado por la fosforilasa13. Se emplea un esquema de reacción acoplada, ilustrado a continuación.
(Glucosa) n + Pi → (Glucosa)n-1 + Glucosa-1-fosfato
Glucosa-1-fosfato → Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
La glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa, y la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconolactona, con la reducción concomitante de NADP + a NADPH. El procedimiento detallado en la sección 2 del protocolo, a continuación, se deriva de los métodos descritos por Mendicino et al.14 y Schreiber & Bowling 15. El ensayo se puede realizar fácilmente de manera continua, con el aumento de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, lo que permite la determinación de la velocidad de reacción.
La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática desramificante se basa en la medición de la glucosa liberada por la acción de la enzima sobre la dexforilasa límite de dextrina16. Este compuesto se elabora tratando el glucógeno exhaustivamente con glucógeno fosforilasa. Dado que la acción de la glucógeno fosforilasa detiene 4 residuos de glucosa lejos de un punto de ramificación α1,6, el límite de dextrina contiene glucógeno, cuyas cadenas externas se han acortado a ~ 4 residuos de glucosa. La preparación de la dextrina límite de fosforilasa se describe aquí, utilizando un procedimiento derivado de los desarrollados por Taylor et al.17 y Makino & Omichi18.
La desramificación es un proceso de dos pasos. La actividad de la 4-α-glucanotransferasa de la enzima desramificante bifuncional transfiere primero tres residuos de glucosa desde el punto de ramificación al extremo no reductor de una cadena de glucosa cercana ligada a α1,4. El único residuo de glucosa ligado a α1,6 que queda en el punto de ramificación es hidrolizado por la actividad de la α1,6-glucosidasa19. El ensayo generalmente se realiza de manera detenida, la glucosa liberada después de un tiempo determinado (o serie de veces) se mide en un ensayo enzimático acoplado como se muestra a continuación:
(Glucosa) n → (Glucosa)n-1 + Glucosa 
Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato + ADP
Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
La determinación de NADPH producido da una medida de la producción de glucosa. El procedimiento descrito en la sección 3 del protocolo, a continuación, se basa en uno descrito por Nelson et al.16. Al igual que los otros métodos que dependen del consumo o la generación de NADH / NADPH, el ensayo es bastante sensible. Sin embargo, la presencia de amilasas u otras glucosidasas, que también pueden liberar glucosa libre de la dextrina límite fosforilasa, causará interferencia significativa (ver Discusión).
La determinación colorimétrica de la actividad enzimática ramificada se basa en el hecho de que las cadenas de glucosa α1,4 adheridas adoptan estructuras helicoidales que se unen al yodo, formando complejos coloreados20. El color del complejo formado depende de la longitud de las cadenas enlazadas α1,4. Por lo tanto, la amilosa, que consiste en cadenas largas, en gran parte no ramificadas, de glucosa ligada a α1,4, forma un complejo azul profundo con yodo. En contraste, los glucógenos, cuyas cadenas externas son generalmente del orden de solo 6 a 8 residuos de glucosa de largo, forman complejos de color rojo anaranjado. Si una solución de amilosa se incuba con enzima ramificada, la introducción de ramas en la amilosa da como resultado la generación de cadenas de glucosa ligadas a α1,4 más cortas. Por lo tanto, el máximo de absorción de los complejos amilosa / yodo se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. El procedimiento discutido aquí se deriva del detallado por Boyer & Preiss21 y la actividad enzimática de ramificación se cuantifica como una reducción en la absorción del complejo amilosa / yodo a 660 nm con el tiempo.
Como debería ser fácilmente evidente a partir de la discusión anterior, el hecho de que los colores de los complejos formados entre las cadenas de yodo y α1,4-glucosa varíen con la longitud de la cadena significa que los espectros de absorbancia de los complejos glucógeno/yodo deberían variar con el grado de ramificación del glucógeno. Este es de hecho el caso, y los glucógenos / glucógenos menos ramificados con cadenas externas más largas absorben la luz a una longitud de onda más larga que los glucógenos que son más ramificados / tienen cadenas externas más cortas. Por lo tanto, la reacción de tinción de yodo puede utilizarse para obtener datos rápidos y cualitativos sobre el grado de ramificación del glucógeno22. El color marrón anaranjado se forma cuando los complejos de glucógeno con yodo no son particularmente intensos. Sin embargo, el desarrollo del color puede mejorarse con la inclusión de una solución saturada de cloruro de calcio22. Esto aumenta la sensibilidad del método unas 10 veces y permite un análisis rápido de cantidades de microgramos de glucógeno. El ensayo para la determinación de la ramificación descrito en la sección 4 del protocolo, a continuación, está adaptado de un procedimiento desarrollado por Krisman22. Se lleva a cabo simplemente combinando la muestra de glucógeno con solución de yodo y cloruro de calcio en una cubeta y recogiendo el espectro de absorción de 330 nm a 800 nm. El máximo de absorbancia cambia hacia longitudes de onda más largas a medida que disminuye el grado de ramificación.
En conjunto, los métodos descritos aquí proporcionan medios simples y confiables para evaluar las actividades de las enzimas clave del metabolismo del glucógeno y para obtener datos cualitativos sobre el alcance de la ramificación del glucógeno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A0456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose</td>
			<td>Biosynth Carbosynth</td>
			<td>YA10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G6893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>10127655001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, Type II from oyster</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexokinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>11426362001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-128</td>
			<td>Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>43420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleoside 5&#39;-diphosphate kinase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>N0379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-glucose, disodium salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>U4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectrophotometric methods for the study of eukaryotic glycogen metabolism

El glucógeno se sintetiza como una forma de almacenamiento de glucosa por una amplia gama de organismos, que van desde bacterias hasta animales. La molécula comprende cadenas lineales de residuos de glucosa ligados a α1,4 con ramas introducidas mediante la adición de enlaces α1,6. Comprender cómo se regulan la síntesis y la degradación del glucógeno y cómo el glucógeno alcanza su estructura ramificada característica requiere el estudio de las enzimas de almacenamiento de glucógeno. Sin embargo, los métodos más comúnmente utilizados para estudiar estas actividades enzimáticas suelen emplear reactivos o técnicas que no están disponibles para todos los investigadores. Aquí, discutimos una batería de procedimientos que son técnicamente simples, rentables y, sin embargo, capaces de proporcionar información valiosa sobre el control del almacenamiento de glucógeno. Las técnicas requieren acceso a un espectrofotómetro, que opera en el rango de 330 a 800 nm, y se describen asumiendo que los usuarios emplearán cubetas de plástico desechables. Sin embargo, los procedimientos son fácilmente escalables y pueden modificarse para su uso en un lector de microplacas, lo que permite un análisis altamente paralelo.

Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa La Figura 1 muestra resultados representativos de ensayos de glucógeno sintasa utilizando enzimas purificadas. En el panel A, después de un ligero retraso, hubo una disminución lineal en la absorción a 340 nm con el tiempo durante un período de alrededor de 12 minutos. La tasa de cambio en la absorción en la Figura 1A fue ~0.12 unidades de absorbancia/min. Una tasa de cambio en la ...

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Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Se presentan técnicas para medir la actividad de enzimas clave del metabolismo del glucógeno, utilizando un espectrofotómetro simple que opera en el rango visible.

Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Los protocolos son significativos, porque evitan el uso de isótopos radiactivos y eliminan una barrera que puede impedir que muchos trabajadores estudien las enzimas del metabolismo del glucógeno. Los procedimientos descritos son económicos y solo requieren acceso a un espectrofotómetro simple. Para comenzar con la determinación de la actividad de la glucógeno sintasa, descongele las soluciones madre previamente preparadas de glucosa UDP, ATP, fosfoenolpiruvato y NDP quinasa en hielo.Precaliente un baño de agua a 30 grados centígrados. Cuando las soluciones madre estén listas, prepare suficiente mezcla de ensayo de acuerdo con el número de ensayos de glucógeno sintasa agregando los reactivos a un tubo de 15 mililitros, como se describe en el protocolo de texto. Prepare una reacción en blanco reemplazando el NADH de la mezcla de reacción con el agua y transfiera la reacción a una cubeta de metacrilato desechable.Utilice la reacción en blanco para establecer cero en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nanómetros. Tome una alícuota de 770 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros, y agregue secuencialmente dos microlitros de mezcla de quinasa NDP quinasa y piruvato quinasa lactato deshidrogenasa al tubo. Después de mezclar, incubar suavemente el tubo a 30 grados centígrados en el baño de agua durante tres minutos para precalentar la mezcla de reacción.A continuación, añadir 30 microlitros de la muestra que contiene glucógeno sintasa en tampón Tris 20 milimolares a pH 7,8, y mezclar suavemente antes de transferir la mezcla de reacción a una cubeta de metacrilato de eliminación. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nanómetros a intervalos cronometrados durante 10 a 20 minutos. Luego, trace las absorbancias obtenidas contra el tiempo.Para medir la glucosa liberada, transfiera 40 microlitros del sobrenadante de las muestras de glucógeno calentadas a las cubetas de metacrilato desechables. Y agregue los volúmenes medidos de trietanolamina, tampón de sulfato de clorhidrato de magnesio, mezcla de ATP NADP y agua como se describe en el manuscrito. Mezclar la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente sin crear burbujas de aire.Agregue 0.5 microlitros de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a cada cubeta. Después de mezclar por pipeteo, incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego registrar la absorbancia a 340 nanómetros. A continuación, mezcle 0,5 microlitros de hexoquinasa a cada cubeta como se describió anteriormente, e incube durante 15 minutos antes de registrar el conjunto absorbente de 340 nanómetros.Luego continúe la incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos, seguido de registrar la absorbancia. Si la absorción ha aumentado de la registrada a los 15 minutos, continuar la incubación durante cinco minutos antes de registrar la absorción final a 340 nanómetros. Para determinar la ramificación del glucógeno, combine 650 microlitros de reactivo de color de cloruro de calcio y yodo con 100 microlitros de agua en un tubo de 1.5 mililitros, y mezcle bien la solución antes de transferirla a una cubeta de metacrilato desechable.Coloque la cubeta en el espectrofotómetro para realizar una carrera en un modo de escaneo de longitud de onda para recolectar el espectro de fondo de 330 a 800 nanómetros. En un tubo separado de 1.5 mililitros, combine 650 microlitros del reactivo de color cloruro de calcio de yodo de trabajo con 50 microgramos de glucógeno de ostra y forme el volumen final a 750 microlitros con agua. Después de mezclar bien la mezcla, transfiera la solución a una cubeta de metacrilato desechable para recolectar un espectro de absorción de 330 a 800 nanómetros.Del mismo modo, obtenga un espectro de absorción con 50 microgramos de amilopectina y 30 microgramos de amilosa como se describió anteriormente. Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 a 50 microgramos del glucógeno con 650 microlitros del reactivo de color cloruro de calcio de yodo en funcionamiento, y proceda como se explicó anteriormente para adquirir el espectro de absorción. En los ensayos de glucógeno sintasa, se observó una disminución lineal en la absorción a 340 nanómetros con el tiempo.Agregar demasiada glucógeno sintasa al ensayo causó que la reacción llegara a completarse en los primeros dos minutos. La reacción de control, que no contenía glucógeno sintasa, no mostró una disminución mensurable en la absorbancia. Los datos de un ensayo de glucógeno fosforilasa utilizando una enzima purificada tuvieron una fase lineal que duró tres minutos.Una tasa de aumento de la absorbancia de alrededor de 0,01 a 0,04 unidades por minuto es óptima. En el ensayo de la enzima de desramificación del glucógeno, la reacción mostró una fase lineal que persistió durante al menos 10 minutos. Los datos representativos de los ensayos de enzimas de ramificación de glucógeno mostraron la diferencia en la absorbancia entre las muestras de control que carecían de enzima ramificada y las reacciones que contenían enzima ramificada.Se ilustra el estrecho rango dinámico del ensayo. El cambio máximo en la absorbancia que se puede producir es de 0,4 unidades de absorbancia, y la linealidad se pierde cuando el cambio en la absorción es de aproximadamente 0,2 unidades de absorbancia. Las masas de glucógeno, amilopectina y amilosa utilizadas en la evaluación de ramificación del glucógeno mostraron una lectura de absorbancia máxima de alrededor de 0,7 a 0,8, cada una con diferentes máximos de absorbancia.La muestra de glucógeno produjo dos picos a aproximadamente 400 nanómetros y 460 nanómetros. El reactivo de color cloruro de calcio yodo es muy denso. Es importante asegurarse de que las muestras de glucógeno estén completamente mezcladas con el reactivo antes de recolectar un espectro de absorción.

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