Immunopeptidomics: Isolering af mus og human mHC klasse I- og II-associerede peptider til massespektrometri analyse

Denne protokol er vigtig, fordi den er enkel at udføre og inden for rækkevidde af ethvert laboratorium. Denne protokol gør det muligt at isolere HLA eller MHC type I eller type II peptider fra menneske- eller museprøver. Denne metode kan behandle videnskabelige spørgsmål relateret til alle forskningsområder, der involverer immunsystemet, hvad enten det er i kræft, virologi eller autoimmune sygdomme.

Denne protokol blev bygget til at være tilgængelig for alle, der arbejder i et forskningslaboratorium. Bare følg trinnene. Begynd at aktivere Sepharose cyanogenbromidperlerne ved at veje 80 milligram pr. prøve og overføre dem til et 15 milliliter konisk rør.

Tilsæt fem milliliter af en millimolar saltsyre. Pipette op og ned fem gange for at lette resuspension af de tørrede perler, og derefter fylde det koniske rør med yderligere 8,5 milliliter af en millimolar saltsyre. Roter perlerne ved 20 omdr./min. i 30 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en rotatoranordning.

Centrifuge perlerne ved 200x G i to minutter ved stuetemperatur og fjerne supernatanten ved aspiration. Tilsæt 500 mikroliter koblingsbuffer til perlerpaletten, og overfør derefter perleaffjedringen til et nyt, to milliliter centrifugerør og sæt det til side. Til kobling af antistofferne til disse perler tilsættes to milligram af det valgte antistof i et nyt, to milliliter mikrocentrifugerør og udgør volumenet til en milliliter med en koblingsbufferopløsning for at få en endelig koncentration på to milligram pr. Milliliter.

Overfør den tidligere forberedte perleopløsning, og tilsæt den til antistofopløsningen. Drej derefter mikrocentrifugerøret ved 20 RPM i 120 minutter ved hjælp af en rotatorenhed, centrifuge perlerne og fjern derefter supernatanten som beskrevet tidligere. Nu begynder at blokere og vaske perlerne ved først at tilføje en milliliter på 0,2-molar glycin til mikrocentrifugerøret, der indeholder antistof-koblede perler, og roterer ved 20 RPM i 60 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en rotator enhed.

Efter centrifugering og fjernelse af supernatanten skal du vaske perlerne med en milliliter PBS, fjerne supernatanten ved centrifugering og opbevare perlerne i en milliliter PBS ved fire grader Celsius indtil brug. For at isolere MHC klasse I eller II peptider, optø en frossen palet af 100 millioner celler ved at opvarme bunden af røret med en håndflade. Tilsæt 500 mikroliter PBS til paletten og pipetten op og ned, indtil suspensionen er homogen.

Overfør suspensionen i et nyt, to milliliter mikrocentrifugerør og tilsæt et tilsvarende volumen af celle lysis buffer. Roter ved 10 omdr./min. i 60 minutter ved fire grader Celsius ved hjælp af en rotatorenhed. Centrifuge cellen lysate ved 18,000x G i 20 minutter ved fire grader Celsius med fuld bremse, og overføre supernatant i en ny, to-milliliter mikrocentrifuge rør.

Gendan de antistof-koblede perler ved centrifugering og fjernelse af supernatanten. Overfør derefter cellelyt supernatanten til de antistofkoblede perler og inkuberer ved 10 RPM i 14 til 18 timer natten over ved fire grader Celsius ved hjælp af en rotatorenhed. På dag to skal du fjerne polypropylens bundlåg, placere kolonnen på polypropylens kolonnestativ og installere en tom beholder nedenunder for at opsamle gennemstrømningen.

Skyl nu polypropylensøjlen med 10 milliliter buffer A og lad den dræne af tyngdekraften. Hvis strømningshastigheden for flydende elution er for langsom, skæres den nederste spids af polypropylenkolonnen yderligere. Mål og indsamle perler / lysat blanding og overføre det til polypropylen kolonne.

Lad den flydende blanding slippe af tyngdekraften. Eventuelt indsamle og fryse 20 mikroliter af aliquot for vestlige blotting. Vask nu perlerne i polypropylensøjlen ved at tilføje 10 milliliter buffer A og lade den slippe af med tyngdekraften.

Fjern polypropylen kolonne fra stativet og placere den på toppen af en ny, to-milliliter mikrocentrifuge rør, holde søjlen og røret sammen med hånden. Tilsæt 300 mikroliter af 1% TFA til polypropylensøjlen og bland perlerne ved at røre op og ned fem gange. Overfør derefter eluatet i et nyt, to milliliter mikrocentrifugerør.

Til afsaltning og udsidning af MHC peptider tilsættes 200 mikroliter methanol oven på C-18 kolonnen og centrifugen ved 1, 546x G i tre minutter for at kassere flow-through. Tilsæt 200 mikroliter på 80% acetonitrile i 0,1% TFA oven på C-18 kolonnen og igen centrifuge for at kassere flow-through. Derefter tilsættes 200 mikroliter på 0,1% TFA, kassér flow-through ved centrifugering.

Endelig indlæses 200 mikroliter af MHC-peptidkomplekserne oven på C-18-kolonnen, kasser strømmen igennem ved centrifugering og gentages, indtil det komplette volumen er indlæst. Derefter tilsættes 200 mikroliter på 0,1% TFA, centrifuge for at kassere flow-through, overføre C-18 kolonnen til et nyt, to milliliter mikrocentrifugerør og elute MHC peptider ved at tilføje 150 mikroliter på 28% acetonitrile i 0,1% TFA. Efter centrifugering opsamles flow-through i et nyt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.

Gentag elutionsprocessen to gange for et samlet volumen på 450 mikroliter, og frys ved minus 20 grader Celsius, indtil den analyseres af LC-MS-MS. Brug disse rensede peptider til identifikation af MHC klasse I og II peptider i et massespektrometer. Perlernes bindende effektivitet blev illustreret ved et betydeligt fald i signalfarvningsintensiteten af lette og tunge kæder, når perler er kovalent bundet til CNBr-perlerne sammenlignet med antistoffet før kobling.

Isoleringen af MHC peptidkomplekser efter sur elution blev bekræftet af det stærke detektionssignal fra MHC peptidkomplekserne ved hjælp af anti-HAL-ABC heavy chain antistof. Den intra-og inter-individuelle reproducerbarhed af resultaterne ved hjælp af den nuværende protokol blev også anslået. Den gennemsnitlige variationskoefficient for antallet af peptider, der blev påvist på tværs af tre forskellige biologiske replikater, var lille, hvilket varierede fra 1,9 til 11%Men identiteten af peptider varierede betydeligt, og andelen af peptider, der blev genroducibly opdaget på tværs af tre biologiske replikater, varierede fra 39% til 63%De genererede varmekort viste forudsagt MHC-bindingsstyrke af de identificerede peptider.

For musen MHC klasse I og klasse II peptider, de prædikerede stærke eller svage bindemidler var 89 og 87%. For menneskelige HLA klasse I og klasse II peptider, de prædikerede stærke eller svage bindemidler var 97 og 70%. Peptid bindende motiver af musen og mennesket for LHC klasse I og klasse II peptider blev også genereret.

Forud for optimeringen af denne protokol var isoleringen af Murine MHC klasse I og II peptider ganske vanskeligere. Denne optimerede protokol vil lette isoleringen af murine MHC klasse I og II peptider fra in vivo musemodeller, for eksempel rutinemæssigt anvendes til validering af mange forskellige, sygdomsrelaterede undersøgelser.