Immunopeptidomikk: Isolering av mus og human MHC klasse I- og II-assosierte peptider for massespektrometrianalyse

Denne protokollen er viktig fordi den er enkel å utføre og innen rekkevidde for ethvert laboratorium. Denne protokollen tillater isolering av HLA eller MHC type I eller type II peptider fra menneskelige eller museprøver. Denne metoden kan ta opp vitenskapelige spørsmål knyttet til alle forskningsområder som involverer immunforsvaret, enten det er i kreft-, virologi- eller autoimmune sykdommer.

Denne protokollen ble bygget for å være tilgjengelig for alle som jobber i et forskningslaboratorium. Bare følg trinnene. Begynn å aktivere Sepharose cyanogenbromidperler ved å veie 80 milligram per prøve og overføre dem til et konisk rør på 15 milliliter.

Tilsett fem milliliter en millimolar saltsyre. Pipette opp og ned fem ganger for å lette resuspension av de tørkede perlene, og fyll deretter konisk rør med ytterligere 8,5 milliliter en millimolar saltsyre. Roter perlene ved 20 RPM i 30 minutter ved romtemperatur ved hjelp av en rotatorenhet.

Sentrifuger perlene ved 200x G i to minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten ved aspirasjon. Tilsett 500 mikroliter koblingsbuffer til perlepaletten, overfør deretter perleopphenget til et nytt sentrifugerør på to milliliter og sett det til side. For kobling av antistoffene til disse perlene, legg til to milligram av det valgte antistoffet i et nytt, to milliliter mikrosenterrør og utgjør volumet til en milliliter med en koblingsbufferløsning for å få en endelig konsentrasjon på to milligram per milliliter.

Overfør den tidligere forberedte perleoppløsningen og legg den til antistoffløsningen. Roter deretter mikrosenterfugerøret ved 20 RPM i 120 minutter ved hjelp av en rotatorenhet, sentrifuger perlene, og fjern deretter supernatanten som beskrevet tidligere. Begynn nå å blokkere og vaske perlene ved først å legge til en milliliter 0,2-molar glycin til mikrocentrifugerøret som inneholder antistoff-koblede perler, og rotere ved 20 RPM i 60 minutter ved romtemperatur ved hjelp av en rotatorenhet.

Etter sentrifugering og fjerning av supernatanten, vask perlene med en milliliter PBS, fjern supernatanten ved sentrifugering, og lagre perlene i en milliliter PBS ved fire grader Celsius til bruk. For å isolere MHC klasse I eller II peptider, tine en frossen palett på 100 millioner celler ved å varme bunnen av røret med en håndflate. Tilsett 500 mikroliter PBS i paletten og pipetten opp og ned til suspensjonen er homogen.

Overfør suspensjonen i et nytt mikrosenterrør på to milliliter og tilsett et likt volum cellelysbuffer. Roter ved 10 RPM i 60 minutter ved fire grader Celsius ved hjelp av en rotatorenhet. Sentrifuger cellelyset ved 18 000x G i 20 minutter ved fire grader Celsius med full brems, og overfør supernatanten i et nytt mikrosenterrør med to milliliter.

Gjenopprett de antistoffkoblede perlene ved sentrifugering og fjern supernatanten. Overfør deretter cellen lysate supernatant til antistoff-koblede perler, og inkuber ved 10 RPM i 14 til 18 timer over natten ved fire grader Celsius ved hjelp av en rotatorenhet. På dag to fjerner du bunnlokket på polypropylenkolonnen, plasserer kolonnen på polypropylenkolonnestativet og installerer en tom beholder under for å samle gjennomstrømning.

Skyll nå polypropylenkolonnen med 10 milliliter buffer A og la den renne ut av tyngdekraften. Hvis strømningshastigheten til flytende elution er for langsom, kutt den nederste spissen av polypropylenkolonnen ytterligere. Mål og samle perlene / lysatblandingen og overfør den til polypropylenkolonnen.

La den flytende blandingen unnslippe av tyngdekraften. Eventuelt samle og fryse 20 mikroliter aliquot for vestlig blotting. Vask nå perlene som beholdes i polypropylenkolonnen ved å legge til 10 milliliter buffer A og la den unnslippe av tyngdekraften.

Fjern polypropylenkolonnen fra stativet og plasser den på toppen av et nytt mikrosenterrør med to milliliter, og hold søylen og røret sammen med hånden. Tilsett 300 mikroliter 1%TFA i polypropylenkolonnen og bland perlene ved å røre opp og ned fem ganger. Deretter overfører du eluate i et nytt mikrosenterrør med to milliliter.

For avsalting og eluting av MHC-peptidene, tilsett 200 mikroliter metanol på toppen av C-18-kolonnen og sentrifugen ved 1546x G i tre minutter for å kaste gjennom gjennomstrømningen. Legg til 200 mikroliter med 80 % acetonitril i 0,1 %TFA på toppen av C-18-kolonnen, og sentrifuger igjen for å forkaste gjennomstrømningen. Deretter legger du til 200 mikroliter på 0,1%TFA, og kaster gjennomstrømningen ved sentrifugering.

Til slutt laster du 200 mikroliter av MHC-peptidkompleksene på toppen av C-18-kolonnen, kaster gjennom strømmen ved sentrifugering og gjentar til hele volumet er lastet. Deretter legger du til 200 mikroliter med 0,1 % TFA, sentrifuge for å kaste gjennomstrømningen, overfører C-18-kolonnen til et nytt mikrocentrifugerør med to milliliter og eluterer MHC-peptider ved å legge til 150 mikroliter 28 % acetonitril i 0,1 %TFA. Etter sentrifugering samler du gjennomstrømningen i et nytt mikrosenterrør på 1,5 milliliter.

Gjenta elution prosessen to ganger for et totalt volum på 450 mikroliter, og frys ved minus 20 grader Celsius til analysert av LC-MS-MS. Bruk disse rensede peptidene for identifisering av MHC klasse I og II peptider i et massespektrometer. Bindingseffektiviteten til perler ble illustrert ved en betydelig reduksjon i signalfargingsintensiteten til lette og tunge kjeder når perler er kovalent bundet til CNBr-perlene, sammenlignet med antistoffet før kobling.

Isolering av MHC peptidkomplekser etter sur elution ble bekreftet av det sterke deteksjonssignalet til MHC-peptidkompleksene ved hjelp av anti-HAL-ABC tungt kjede antistoff. Den intra- og mellom individuelle reproduserbarheten av resultatene ved hjelp av den nåværende protokollen ble også estimert. Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten for antall peptider som ble påvist på tvers av tre forskjellige biologiske replikeringer var liten, noe som varierte fra 1,9 til 11%Imidlertid varierte identiteten til peptider betydelig, og andelen peptider som ble reprodusinert på tvers av tre biologiske repliker varierte fra 39% til 63%Varmekartene som ble generert viste anslått MHC-bindingsstyrke av de identifiserte peptidene.

For musen MHC klasse I og klasse II peptider var de predikerte sterke eller svake bindemidlene henholdsvis 89 og 87%. For humane HLA klasse I og klasse II peptider var de predikerte sterke eller svake bindemidlene henholdsvis 97 og 70%. Peptidbindende motiver av musen og mennesket for LHC klasse I og klasse II peptider ble også generert.

Før optimaliseringen av denne protokollen var isolasjonen av murine MHC klasse I og II peptider ganske vanskeligere. Denne optimaliserte protokollen vil lette isolering av murine MHC klasse I og II peptider fra in vivo musemodeller, for eksempel rutinemessig brukt til validering av mange forskjellige, sykdomsrelaterte studier.