Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ve T32 HL134616 (Sturgill ve Salyer) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm prosedürler, Ohio State Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından NIH kurallarına uygun olarak onaylanmıştır.
1. Çözelti hazırlama
NOT: Tampon konsantrasyonları için lütfen Tablo 2'ye bakınız.
<ol><li>Ön izolasyon (miyosit izolasyonundan 2 hafta öncesine kadar)<ol><li>Perfüzyon tampon bazı: 1 L ultra saf 18.2 MΩ · cm H...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Langendorff içermeyen kardiyomiyosit izolasyon tekniğimizin temel avantajı, Langendorff cihazına kanülasyon gerektirmeyerek hipoksi ve iskemik zamanı sınırlamasıdır. Kalbin çıkarılması, temizlenmesi ve asılması birkaç dakika süren ve genellikle miyositte iskemik hasara neden olan klasik Langendorff tekniklerine alternatif olarak, yöntemimiz buz gibi soğuk bir temizleme çözeltisi ile kanın in vivo temizlenmesini içerir. Buz gibi soğuk temizleme tamponu, etilendiamintetraasetik as...

On yıllar boyunca, kardiyak biyoloji literatüründe önemli bir fikir, moleküler etki mekanizmasıdır. Güvenilir çalışmaların yayınlanması için etki mekanizması kurulmalıdır. Moleküler mekanizmayı belirlemek için iyi kurulmuş bir strateji, güvenilir verilere ulaşmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gerektiren izole kardiyomiyosit çalışmalarıdır. Kardiyomiyositler üzerinde etki mekanizmasını belirlemek için yapılan hücresel ve moleküler deneyler kasılma1, elektrofizyoloji2, kalsiyum (Ca2+) döngüsü3, miyofilamanCa2+ duyarlılığı4, hücre iskeleti5, metabolizma6, hormonların etkileri7, sinyal molekülleri8, ilaç çalışmaları9 araştırmak için altın standarttır ve saire. Fare, genetik manipülasyonun kolaylığı, küçük boyutu, nispeten kısa ömrü, düşük maliyeti vb.10 nedeniyle çoğu kardiyak biyoloji deneyi için tercih edilen tür haline gelmiştir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli fare kardiyomiyositlerinin güvenilir izolasyonu, mevcut tekniklerle önemsiz değildir.
Laboratuvarlar neredeyse 70 yıldır kardiyomiyositleri izole ediyor11. Kardiyomiyositleri izole etmek için hemen hemen tüm teknikler, kalbin çeşitli enzimler (kollajenaz, proteaz, tripsin vb.) Erken dönemlerde (1950'ler-1960'lar), kalbin çıkarılmasını, çok daha küçük parçalara ayrılmasını ve kollajenaz / proteaz / tripsin12 ile çözelti içinde inkübe edilmesini içeren yığın yöntemi kullanılmıştır. 1970'lerde laboratuvarlar, koroner arter perfüzyonuna dayalı bir izolasyon tekniği (Langendorff cihazı aracılığıyla enzim ile retrograd perfüzyon) kullanarak kardiyomiyositleri izole eden iyileştirilmiş "Langendorff" yöntemi13'ü uyguladı; Bu teknik, bugün sahada miyosit izolasyonunun baskın yöntemi olmaya devam etmektedir, ~ 50 yıl sonra14,15,16. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hipoksi süresini ve iskemik hasarı sınırlamak için kalbin in vivo olarak kanüle edilmesine kaymıştır ve bu da üstün kardiyomiyosit izolasyonları (daha iyi verim ve daha yüksek kalite) ile sonuçlanmıştır17. Son zamanlarda, bu in vivo, Langendorff içermeyen kalp perfüzyonları 18,19,20,21,22 performans göstermeye dönüşmüştür. Langendorff-free kardiyomiyosit izolasyon tekniğini Ackers-Johnson ve ark.18 tekniğine dayanarak geliştirdik ve önceki birçok izolasyon tekniğinden çeşitli bileşenleri uyarladık. Bu önemli uyarlamalar, buz gibi soğuk bir temizleme tamponunun enjeksiyonunu ve iğneyi stabilize etmek için destekleyici bir platformun dahil edilmesini içerir ve bu da kalbin manipülasyonunun azaltılmasına izin verir. Bu teknikte ayrıca ayrıntılı olarak açıklanan, enjekte edilen tamponların sıcaklık kontrolüdür (37 ° C), bu da daha önce yayınlandığı gibi daha az EDTA perfüzyonu nedeniyle in vivo enjeksiyon ve sindirim arasındaki süreyi azaltmıştır18. Kalbin manipülasyonunu azaltarak ve dolayısıyla delinme yeri boyutunu en aza indirerek, koroner arterlerin tam ve sürekli perfüzyonu elde edilir. Ayrıca tekniği ikincil bir yığın yöntemi sindirimi, enjekte edilen temizleme tamponundaki EDTA miktarı ile rafine ettik ve pH'ı değiştirdik. Tarif ettiğimiz teknik daha güvenilir, daha verimlidir ve Langendorff aparatının kullanımına kıyasla kapsamlı bir eğitim/uygulama gerektirmez (Tablo 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

Yüksek kaliteli kardiyomiyositler veren tekrarlanabilir ancak teknik olarak basit yöntemlere duyulan ihtiyaç, kalp biyolojisindeki araştırmalar için gereklidir. Kardiyomiyositler üzerinde yapılan hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler (örneğin, kasılma, elektrofizyoloji, kalsiyum döngüsü, vb.) hastalığın mekanizmalarını belirlemek için altın standarttır. Fare, fonksiyonel deneyler için tercih edilen türdür ve açıklanan teknik, özellikle fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu içindir. Langendorff aparatı gerektiren önceki yöntemler, aort kanülasyonu için yüksek düzeyde eğitim ve hassasiyet gerektirir ve sıklıkla iskemi ile sonuçlanır. Alan, basit, tekrarlanabilir ve fizyolojik veri toplama ve kültür için uygulanabilir miyositler veren Langendorff'suz izolasyon yöntemlerine doğru kaymaktadır. Bu yöntemler aort kanülasyonuna kıyasla iskemi süresini büyük ölçüde azaltır ve güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositlerle sonuçlanır. Langendorff'suz yönteme adaptasyonumuz, buz gibi soğuk temizleme çözeltisi ile ilk perfüzyonu, perfüzyon sırasında sabit bir iğne sağlayan stabilize edici bir platformun kullanımını ve fonksiyonel ölçümlerde ve kültürde kullanılmak üzere güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositleri sağlamak için ek sindirim adımlarını içerir. Bu yöntemin uygulanması basit ve hızlıdır ve çok az teknik beceri gerektirir.

Bir izolasyonun başarısını belirlerken incelenmesi gereken birkaç unsur vardır. İlk olarak, kardiyomiyositler, Şekil 1'de izole edilen hücreler gibi membran lekeleri olmadan çubuk şeklinde olmalıdır. Tipik bir izolasyon, çubuk şeklindeki miyositlerin ~% 80'ini verecektir. İzolasyon% 50'den daha az çubuk şeklindeki hücreler verirse, başarısız bir izolasyon olarak kabul edilir ve kardiyomiyositler kullanılmaz. Son olarak, kardiyomiyositler sessiz olmalıdır. Spontan kon...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Bu teknik daha güvenilir ve verimlidir ve en yaygın kullanılan Langendorff aparat tekniklerine kıyasla kapsamlı bir uygulama veya eğitim gerektirmez. Bu tekniğin temel avantajı, ilk perfüzyon in vivo olarak gerçekleştiği için iskemik zamanı sınırlamasıdır. Bu tekniği uygularken, manifolddaki kabarcıklardan kaçınmak ve sindirim sırasında kalbin aşırı hareketinden kaçınmak önemlidir, bunlar verimi düşürebilir.Bu tekniği gösteren, Dr. Mark Ziolo'nun laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Sturgill olacak. Yeni hazırlanmış perfüzyon tamponunu kullanarak sıcaklık kontrollü manifoldun temizlenmesiyle başlayın. Bunu yapmak için, 27 gauge'lik bir iğneye vidalayın ve bir luer kilit konektörü kullanarak kabarcıkları temizleyin.Hiçbir kabarcık kalmadığından emin olun. Kardiyomiyositi izole etmek için, tamamen anestezi uygulanan farenin sternumunu ve orta hatta yanal olarak maruz bırakın, kaburgalardan ve aksilladan proksimal olarak kesin. Daha sonra diyaframı kesin ve kalbi önlemek için sığ kesimler sağlayın.Sternumu bir hemostatla sıkıştırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru katlayın. İnferior vena kava'yı hemen kalbe distal kesmeden önce perikardı kalpten yavaşça çıkarın. 27 gauge'lik bir iğne kullanarak bir dakika boyunca kalbin sağ ventrikülüne üç mililitre buz gibi soğuk temizleme tamponu enjekte edin.Ardından, cımbız kullanarak kalbi tutun. Vücuttan uzağa çekin ve aortun mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkarın. Daha sonra yükselen aortu bir hemostat kullanarak kelepçeleyin ve kalbi eksize edin.Kelepçeli kalbi hızlı bir şekilde 10 mililitre sıcak perfüzyon tamponu içeren bir polipropilen Petri kabının kapağına aktarın. Kelepçeli kalbi destek platformuna yerleştirin ve manifolda bağlı stabilize edilmiş 27 gauge iğne kullanarak beş dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derecede 10 mililitre sıcaklık kontrollü perfüzyon tamponu enjekte edin. Ardından, kelepçeli kalbi ve destek platformunu yaklaşık beş mililitre sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın.Giriş şırıngalarını, 25 mililitre sindirim tamponu içeren 50 mililitrelik bir şırınga için değiştirin. Enjeksiyondan önce herhangi bir kabarcığın manifoldunu ve kalan perfüzyon tamponunu temizleyin. İğneyi dikkatlice sol ventrikül tepesindeki aynı iğne pozisyonuna yerleştirin.Bir perfüzyon pompası yardımıyla, 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak 15 dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derece sindirim tamponu enjekte edin. Çözeltinin sıcaklığını, 37 santigrat derece çözeltiyi çıkarmak için kalibre edilmiş bir su ceketi ile kontrol edin. Ventrikülleri 10 mililitrelik bir behere aktarmadan önce atriyumdan çıkarın.Beherin içine üç mililitre sindirim tamponu ekleyin ve ventrikülleri keskin makas kullanarak büyük parçalar halinde kesin. Beheri alüminyum folyo ile örtün ve beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış sallanan bir su banyosuna yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, doku parçalarını üç mililitre sindirim tamponunda yeniden askıya alın ve yaklaşık dört dakika boyunca veya homojen bir karışım elde edilene kadar tritüre edin.İşiniz bittiğinde, hücreleri 70 mikrometrelik naylon hücre süzgeci kullanarak 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe filtreleyin. Naylon hücre süzgecini üç mililitre sindirim tamponu ile yıkayın. Filtratı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe geri koyun ve santrifüj edin.Peletleri üç mililitre durdurma tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Hücre süspansiyonuna, nihai kalsiyum klorür konsantrasyonunu 1.8 milimolar yapmak için 54 mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür stoğu ekleyin. Canlı hücrelerin 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve ölü hücreler içeren süpernatantı çıkarın.Pelet bir depolama çözeltisinde yeniden askıya alındıktan sonra, hücreler fonksiyonel deneyler ve kültürler için kullanılabilir. İzole hücrelerin parlak alan mikroskop görüntüleri, fare kardiyomiyositlerinin izolasyonunun, membran lekeleri veya yuvarlak kenarları olmayan çubuk şeklinde sessiz hücreler ürettiğini göstermiştir. Hücreler, izolasyon tekniğinin başarısını belirleyen yaklaşık% 80 verim ve yüksek sağkalım oranları göstermiştir.Başarılı bir izolasyon için, kabarcıkları manifolddan çıkarmak ve iğneyi kalpteki aynı deliğe sokmak en önemlisidir. İzole edildikten sonra, kardiyomiyositler hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Kısmi ligasyon Fare Karotis Arter Disturbed Akış Kaynaklı Ateroskleroz ve Karotis Endotel RNA İzolasyonu Basit Bir Yöntem Bir Model

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Basit Fare İntrakranial Xenograftlarında Çalışmaları Kılavuzu Vida Yöntemi

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Fare Akciğer Entübasyonun Basit Bir Yöntem

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Farelerde Basit Kritik ölçekli Femoral Hata Modeli

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Basit Aygıt Hızla Fare Bağırsak Tüm Mounts Hazırlanır

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Basit mekanik Prosedür Mouse Limbal Kök Hücre Eksikliği oluşturma

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Pankreas Kanalı infüzyonu: İlaç ve Viral Doğumda Etkili ve Seçici Bir Yöntem

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D ultrason görüntüleme: hızlı ve uygun maliyetli morfometri kas-iskelet dokusunun

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...