Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور فرانك شولي لتعليقاته المفيدة في المخطوطة، وكلوي ماريانت لمساعدتها في تصوير المجهر وتيريزا م. تيدج لتنقيحها المفيد للغة الإنجليزية.

1. بروتوكول المعايرة
ملاحظة: استخدام فيروس cytopathic تصيب الخلايا الملتصقة. لهذه المظاهرة، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير (A/California/07/2009/(H1N1)) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) نوع 2، سلالة NC 1-7-4 استخدمت.
<ol><li>يسوي هذه الفيروسات في 96 لوحة بئر لمدة 7 أيام ?...

<ol>
	<li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments.">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints.">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+right+and+wrong+cases+(constant+stimuli)+without+Gauss's+formulae.">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).</li><li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+assay+methods:+accuracy+and+validation.">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li><li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+virus+isolation,+polymerase+chain+reaction,+immunohistochemistry,+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs.">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li><li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effects+of+viruses+protocols.">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Y&#225;ng&#252;ez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influenza Virus. , 59-88 (2018).</li><li>Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV:+an+immunohistochemical+study.">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs.">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li><li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods.">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li></ol>

وتستخدم المعايرة الفيروسية بشكل روتيني في أبحاث الفيروسات، مع الكشف عن PFU وتقيايس TCID50 الأكثر استخداما1،2،3،4. تعتمد كلتا الطريقتين على اكتشاف CPE في الخلايا المصابة ، وعلى الرغم من أنه يمكن تقييمها بصريا عن طريق المج...

المعايرة الفيروسية عن طريق TCID50 المقايسة هي تقنية شائعة الاستخدام في أبحاث الأمراض المعدية1. على الرغم من أن الاختلافات في الرياضيات وراء هذه الطريقة قد اقترحت على مدى الوقت1,2,3,4, تعتمد الطرق المطبقة حاليا للكشف عن العدوى على تأكيد بصري من خلال وجود تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) باستخدام المجهر5. لتأكيد التصور CPE أكثر موضوعية على المقايسات TCID50، immunocytochemical (ICC) تلطيخ داخل الخلايا التي تستهدف بروتينات الفيروس هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما6 كما يمكن للفيروسات المختلفة تنتج أشكال مختلفة من CPE. في حالتنا ، فإن التغيرات المورفولوجية للخلايا متشابهة عند إصابتها بكل من فيروس الأنفلونزا A (IAV) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) ، حيث تتراكم الخلايا المصابة وتنفصل عن اللوحة. في حالة PRRSV ، فإنه يسبب CPE المعروفة باسم "التدمير الكامل" ، حيث ينتهي الأمر بجميع الخلايا إلى الانفصال عن البئر. IAV من ناحية أخرى، يمكن أن تقدم كل من التدمير الكامل وCPE إضافية تعرف باسم "تدمير المجموع الفرعي" حيث عدد قليل من الخلايا لا تنفصل بعد العدوى7. ومع ذلك، تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا في الأداء وتتطلب استخدام الكواشف المكلفة نسبيا. من المهم ملاحظة أن المحكمة الجنائية الدولية لا تسمي CPE ، بل عدد الخلايا المصابة بنجاح بالفيروس. وهذا يعني أن الخلايا التي أصيبت بنجاح بحلول نهاية الحضانة سينظر إليها على أنها إيجابية حتى لو لم تسبب العدوى CPE حتى الآن ، وبالتالي ، من المتوقع أن تكون نسبة أعلى من الخلايا الإيجابية للمحكمة الجنائية الدولية مقارنة ب CPE. لهذا السبب، في هذه الدراسة نصف طريقة تكميلية للكشف البصري عن CPE في اختبار TCID50 على أساس البنفسجي الكريستال، وهي مادة كيميائية مع تهمة إيجابية التي تعلق على أغشية الخلايا ويستخدم لتلطخ الخلايا الملتصقة. وغالبا ما يستخدم الكريستال البنفسجي في بحوث علم الفيروسات لقياس وحدات تشكيل البلاك، من بين أمور أخرى8.
في هذه الدراسة، نقارن حساسية الكشف عن ال CPE المجهر غير الملون مع تلطيخ الكريستال البنفسجي وتلطيخ المناعة الكيميائية على أساس التعرف على البروتين الفيروسي، والذي هو معروف أن يكون أكثر موضوعية نظرا لحساسية عالية. وتبين هذه الدراسة أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ الكيميائية المناعية هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية القائمة على المجهر ويمكن استخدامها لتحديد موضوعي الآبار المصابة في المعايرة TCID50. نظرا لقدرتها على الوصول إلى مستوى مماثل تقريبا من الدقة على الفيروسات الباثاثية اختبارها في خطوط الخلية، يتم تقديم الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50. الطريقة المقترحة باستخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ يستغرق ما مجموعه 40 دقيقة لأداء، مع 15 دقيقة لاحتضان paraformaldehyde (PFA)، 5 دقائق لاحتضان الكريستال البنفسجي والحد الأقصى من 15 دقيقة لإعداد المواد، يغسل العازلة، والتجفيف. بروتوكول الكيمياء المناعية المطبق للمقارنة يستغرق متوسط الوقت 4 ساعة 30 دقيقة، وكان يؤديها كما هو موضح سابقا9،10. وتهدف الطريقة المقترحة إلى المساعدة في تصور المعايرة الفيروسية المكتملة. يمكن إجراء العدوى وأوقات الحضانة مع تخطيط مختلف اعتمادا على الفيروس. هنا اختبرنا اثنين من فيروسات الحمض النووي الريبي مع تأثير cytopathic على خطوط الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

المعايرة الفيروسية هي المقايسة الرئيسية لأبحاث الفيروسات. الكشف عن تأثير الخلايا (CPE) عن طريق المقايسات TCID50 ووحدات تشكيل البلاك (PFU) المقايسات هي الطريقتين الرئيسيتين لحساب titer من مخزون الفيروس وغالبا ما تستند إلى الكشف المجهري أو تلطيخ الخلايا للتصور. في حالة اختبار TCID50 ، يستند التصور الموضوعي عادة إلى تلطيخ المناعة الكيميائية (ICC) للفيروس داخل الخلايا لحساب الثديات جنبا إلى جنب مع الكشف البصري عن CPE عن طريق المجهر. ومع ذلك ، فإن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. في هذه الدراسة، قارنا المراقبة البصرية CPE عن طريق المجهر، تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية وتلطيخ الكريستال البنفسجي لتحديد الثدي من اثنين من الفيروسات تشكيل CPE، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV). نظهر أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ ICC هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية، وتقديم مستويات متطابقة تقريبا من الدقة على كل من IAV وPRRSV. لهذا السبب، نقدم هنا تلطيخ الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50 للفيروسات تشكيل CPE titrated في خطوط الخلية.

المعادلات المستخدمة لحساب رياضيا titer وصفت سابقا2،3.
باختصار، بالنسبة ل PRRSV، نطبق طريقة Karber:
تيتر (TCID50) = 10 T + 1.3 حيث:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg">
في هذه الصيغة د = سجل سلبي من التخفيف الأخ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

يظهر هذا البروتوكول نهجا دقيقا وموضوعيا لتصور المعايرة الفيروسية باستخدام اللون البنفسجي البلوري ، من خلال مقارنتها بالفحص المجهري البصري والتلوين الكيميائي المناعي.

استخدام كريستال البنفسجي لتحسين البصرية Cytopathic تأثير القائم على القراءة ل Titration الفيروسية باستخدام TCID50 المقايسات

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج صورة مخزون الفيروس وتصور ذلك باستخدام تلطيخ الكريستال البنفسجي. للقيام بذلك ، سيتم إثبات المعايرة الفيروسية العامة تليها التلطيخ. وسيتم إجراء هذا المعايرة في صفيحة من 96 بئرا لمدة سبعة أيام في خزانة السلامة البيولوجية داخل مختبر من المستوى 2 للسلامة البيولوجية.للقيام بذلك، سيتم بذر لوحة 96 جيدا من خط الخلية المفضل باستخدام وسائل الإعلام المقابلة والسماح للنمو حتى التقاء. وسوف يكون مخزون الفيروس المخفف باستخدام تخفيف عشرة أضعاف، عن طريق خلط 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام و 100 ميكرولتر من الفيروس، أو التخفيف المقابلة. تأكد من دوامة كل أنبوب لضمان الخلط السليم للوسائط والفيروس وتجنب الأخطاء على التخفيفات.اكتب تخطيط لوحة الخاص بك في الرصاص، فضلا عن كل تخفيف للمساعدة أثناء عملية العدوى. قبل الإصابة، اغسل باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميكرولتر من inoculum الخاص بك في الآبار المقابلة.ثم، احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة سبعة أيام. بعد سبعة أيام حضانة، وغسل باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من PFA في 4٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد الحضانة، تغسل الخلايا مرة أخرى مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من الكريستال البنفسجي في الماء واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، يستنشق البنفسجي الكريستال من الآبار واختياريا، وترك لوحات للهواء الجاف لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أو غسله مع 200 ميكرولتر من الماء لإزالة وصمة عار مفرطة قبل التصور. ونتيجة لذلك، بعد إعادة تلطيخ، سيتم تلوين الخلايا السلبية.سيتم تطهير الآبار الإيجابية. سيتم استخدام هذه المعلومات في إحدى الصيغتين الموصوفتين لحساب titer الفيروسي النهائي الخاص بك. عندما تمت مقارنة التيتر التي تم الحصول عليها مع كل طريقة، أظهرت أنه في تلطيخ الكيمياء أحادية الكيسة يمكن في بعض الحالات الكشف عن آبار إيجابية إضافية بالمقارنة مع الكريستال البنفسجي، وأنه بالمثل، يمكن لكلا أساليب التلطيخ الكشف عن آبار أكثر إيجابية من التقييم البصري عن طريق المجهر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

تقييم التغيرات الأيضية الكبدي خلال الاستعمار التدريجي الماوس مجانا من جرثومة 1 H NMR الطيفي

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...