Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
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作者要感谢Frank Scholle博士在手稿中的有益评论，Chloe Mariant对显微镜图像的帮助以及Teresa M. Tiedge对她有用的英文修订。

1. 滴定方案
注意：使用感染贴壁细胞的细胞病变病毒。在本次演示中，使用了猪源性甲型流感病毒（IAV）（A/California/07/2009/（H1N1））和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）2型NC 1-7-4。
<ol><li>在位于生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全柜中，在96孔板中滴定这些病毒7天。<ol>
<li>为了进行这些滴定，用所需的细胞系接种96孔板。对于 PRRSV，使用 MA-104 细胞系，对于 IA...

<ol>
	<li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments.">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints.">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+right+and+wrong+cases+(constant+stimuli)+without+Gauss's+formulae.">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).</li><li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+assay+methods:+accuracy+and+validation.">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li><li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+virus+isolation,+polymerase+chain+reaction,+immunohistochemistry,+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs.">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li><li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effects+of+viruses+protocols.">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Y&#225;ng&#252;ez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influenza Virus. , 59-88 (2018).</li><li>Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV:+an+immunohistochemical+study.">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs.">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li><li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods.">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li></ol>

病毒滴定法通常用于病毒学研究，最常用的是PFU检测和TCID50测定1，2，3，4。这两种方法都依赖于感染细胞中CPE的检测，即使 可以通过显微镜对 它们进行视觉评估，通常也要进行染色以获得更客观的结果，甚至减少孵育时间。就 TCID50 而言，ICC 染色是视觉 CPE 检测最常用的替代方法之一，可提?...

通过 TCID50 测定进行病毒滴定是传染病研究中常用的技术1。尽管随着时间的推移，已经提出了该方法背后的数学变化1，2，3，4，但目前应用的感染检测方法依赖于通过使用显微镜的细胞病变效应（CPE）的存在进行视觉确认5。为了在 TCID50 测定中更客观地确认 CPE 可视化，靶向病毒蛋白的免疫细胞化学 （ICC） 细胞内染色是最常用的方法之一6，因为不同的病毒可以产生不同形式的 CPE。在我们的例子中，当感染甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）时，细胞形态变化是相似的，其中受感染的细胞从板中聚集并分离。在PRRSV的情况下，它会导致称为"完全破坏"的CPE，其中所有细胞最终都从孔中分离出来。另一方面，IAV可以同时存在完全破坏和称为"次级破坏"的额外CPE，其中少量细胞在感染后不会分离7。然而，这种技术执行起来非常耗时，并且需要使用相对昂贵的试剂。重要的是要注意，ICC不标记CPE，而是标记被病毒成功感染的细胞数量。这意味着，即使感染尚未引起CPE，在孵育结束时成功感染的细胞也将被视为阳性，因此，与CPE相比，ICC阳性细胞的比例更高。出于这个原因，在这项研究中，我们描述了一种基于晶体紫的TCID50测定中CPE视觉检测的补充方法，晶体紫是一种具有正电荷的化学物质，附着在细胞膜上并用于染色贴壁细胞。晶体紫通常用于病毒学研究，以测量斑块形成单位等8。
在这项研究中，我们将非染色显微镜CPE检测与基于病毒蛋白识别的结晶紫染色和免疫细胞化学染色的灵敏度进行了比较，由于其高灵敏度，已知其更客观。该研究表明，结晶紫染色和免疫细胞化学染色都比基于视觉显微镜的CPE检测更准确，可用于在TCID50滴定中客观地鉴定感染孔。鉴于它们在细胞系中测试的细胞病变病毒上能够达到几乎相同的准确度，因此晶体紫被呈现为在TCID50测定中测定病毒滴定更快，更实惠的方法。所提出的使用晶体紫染色的方法需要40分钟的总时间，多聚甲醛（PFA）孵育15分钟，晶体紫孵育5分钟，材料制备，缓冲液洗涤和干燥最长15分钟。用于比较的免疫细胞化学方案平均需要4小时30分钟的时间，并如前所述进行9，10。所提出的方法旨在帮助可视化完成的病毒滴定。感染和潜伏时间可以根据病毒的不同布局进行。在这里，我们测试了两种对细胞系具有细胞病变作用的RNA病毒。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

病毒滴定是病毒学研究的关键检测方法。 通过 TCID50 检测和斑块形成单元 （PFU） 检测细胞病变效应 （CPE） 是计算病毒储备滴度的两种主要方法，通常基于显微镜检测或细胞染色进行可视化。在 TCID50 测定的情况下，客观可视化通常基于细胞内病毒的免疫细胞化学 （ICC） 染色，以计算滴度， 并通过显微镜进行 视觉 CPE 检测。然而，ICC染色既昂贵又耗时。在这项研究中，我们比较了 通过 显微镜，ICC染色和结晶紫染色的视觉CPE观察，以确定两种CPE形成病毒的滴度，猪源性甲型流感病毒（IAV）和猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）。我们表明，结晶紫和ICC染色都比视觉CPE检测更准确，在IAV和PRRSV上呈现几乎相同的精度水平。出于这个原因，在这里，我们将结晶紫染色作为一种更快，更实惠的方法，用于在TCID50测定中测定细胞系中滴定的CPE形成病毒。

用于数学计算滴度的方程之前已有描述2，3。
简而言之，对于PRRSV，我们应用Karber方法：
滴度 （TCID50） = 10 T + 1.3 其中：
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg">
在此公式中，d = 具有完全阳性病毒反应的最后稀释的负对数：五个阳性重复;r = 稀释范围...

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Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

该协议显示了一种准确客观的方法，通过将晶体紫与光学显微镜和免疫细胞化学染色进行比较，可视化病毒滴定。

使用晶体紫改善使用 TCID50 检测法进行病毒滴定的基于视觉细胞病变效应的读数

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

该协议的目标是产生病毒储备滴定并使用结晶紫染色将其可视化。为此，将演示一般的病毒滴定，然后进行染色。该滴定将在生物安全2级实验室的生物安全柜中在96孔板中进行，为期七天。为此，将使用相应的培养基接种首选细胞系的96孔板并使其生长直至汇合。将病毒原液稀释后使用十倍稀释液，通过混合900微升培养基和100微升病毒，或相应稀释。确保涡旋每个管子，以确保培养基和病毒的适当混合，并避免稀释液的错误。在导联物中写下您的板的布局以及每次稀释，以帮助感染过程。感染前，使用200微升PBS洗涤。在相应的孔中加入50微升的接种物。然后，在5%CO2培养箱中以37摄氏度孵育7天。孵育七天后，使用200微升PBS洗涤。通过在PBS中加入每孔50微升PFA以4%固定细胞，并在室温下孵育15分钟。孵育后，再次用200微升PBS洗涤细胞两次，然后在水中加入每孔50微升结晶紫，并在室温下孵育五分钟。最后，从孔中吸取结晶紫，并任选地，将板在室温下风干两到五分钟，或用200微升水洗涤，以在可视化之前去除多余的污渍。结果，在重新染色后，阴性细胞将被染色。阳性井将被清除。此信息将用于两个描述的公式之一，以计算您的最终病毒滴度。当比较每种方法获得的滴度时，它表明在单核细胞化学中，与结晶紫相比，在某些情况下，染色可以检测到额外的阳性孔，同样，两种染色方法都可以检测到比通过显微镜进行视觉评估更多的阳性孔。

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