Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Auteurs willen graag Dr. Frank Scholle bedanken voor zijn nuttige opmerkingen in het manuscript, Chloe Mariant voor haar hulp bij de microscopiebeelden en Teresa M. Tiedge voor haar behulpzame Engelse revisie.

1. Titratieprotocol
OPMERKING: Gebruik een cytopathisch virus dat hechtende cellen infecteert. Voor deze demonstratie werden Influenza A Virus (IAV) van varkensoorsprong (A/California/07/2009/(H1N1)) en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stam NC 1-7-4 gebruikt.
<ol><li>Titreer deze virussen in 96 putplaten gedurende 7 dagen in een bioveiligheidskast in een Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.<ol>
<li>Om deze titraties uit te voeren, zaait ...

<ol>
	<li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments.">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints.">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+right+and+wrong+cases+(constant+stimuli)+without+Gauss's+formulae.">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).</li><li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+assay+methods:+accuracy+and+validation.">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li><li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+virus+isolation,+polymerase+chain+reaction,+immunohistochemistry,+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs.">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li><li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effects+of+viruses+protocols.">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Y&#225;ng&#252;ez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influenza Virus. , 59-88 (2018).</li><li>Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV:+an+immunohistochemical+study.">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs.">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li><li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods.">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li></ol>

Virale titraties worden routinematig gebruikt in virologisch onderzoek, met PFU-detectie en TCID50-assays die het meest worden gebruikt1,2,3,4. Beide methoden zijn gebaseerd op de detectie van CPE in geïnfecteerde cellen, en hoewel ze visueel kunnen worden beoordeeld via microscopie, wordt een kleuring meestal toegepast om een objectiever resultaat te verkrijgen of zelfs de incubatiet...

Virale titratie via TCID50-test is een veelgebruikte techniek in onderzoek naar infectieziekten1. Hoewel variaties op de wiskunde achter deze methode in de loop van de tijd zijn voorgesteld1,2,3,4, zijn de momenteel toegepaste methoden voor infectiedetectie afhankelijk van visuele bevestiging door de aanwezigheid van cytopathisch effect (CPE) met behulp van microscopie5. Om CPE-visualisatie objectiever te bevestigen op TCID50-assays, is immunocytochemische (ICC) intracellulaire kleuring gericht op de eiwitten van het virus een van de meest gebruikte methoden6, omdat verschillende virussen verschillende vormen van CPE kunnen produceren. In ons geval zijn de celmorfologische veranderingen vergelijkbaar wanneer ze zijn geïnfecteerd met zowel influenza A-virus (IAV) als porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), waarbij geïnfecteerde cellen worden afgerond en loskomen van de plaat. In het geval van PRRSV veroorzaakt het een CPE die bekend staat als "totale vernietiging", waarbij alle cellen uiteindelijk loskomen van de put. IAV daarentegen kan zowel totale vernietiging als een extra CPE presenteren die bekend staat als "subtotale vernietiging" waarbij een klein aantal cellen niet loskomt na infectie7. Deze techniek is echter tijdrovend om uit te voeren en vereist het gebruik van relatief dure reagentia. Het is belangrijk op te merken dat ICC cpe niet labelt, maar eerder het aantal cellen dat met succes door het virus is geïnfecteerd. Dit impliceert dat de cellen die aan het einde van de incubatie met succes zijn geïnfecteerd, als positief worden beschouwd, zelfs als de infectie nog geen CPE heeft veroorzaakt, en dus wordt een hoger percentage ICC-positieve cellen in vergelijking met CPE verwacht. Om die reden beschrijven we in deze studie een complementaire methode van visuele detectie van CPE in een TCID50-assay op basis van kristalviolet, een chemische stof met een positieve lading die zich hecht aan celmembranen en wordt gebruikt om aanhangende cellen te kleuren. Kristalviolet wordt vaak gebruikt in virologisch onderzoek om plaquevormende eenheden te meten, onder andere8.
In deze studie vergelijken we de gevoeligheid van niet-gekleurde microscopie CPE-detectie met kristalviolette kleuring en immunocytochemische kleuring op basis van virale eiwitherkenning, waarvan bekend is dat deze objectiever is vanwege de hoge gevoeligheid. Deze studie toont aan dat zowel kristalviolet als immunocytochemische kleuring nauwkeuriger zijn dan op visuele microscopie gebaseerde CPE-detectie en kan worden gebruikt om geïnfecteerde putten objectief te identificeren in een TCID50-titratie. Gezien hun vermogen om bijna identiek niveau van nauwkeurigheid te bereiken op de cytopathische virussen die in cellijnen zijn getest, wordt kristalviolet gepresenteerd als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test. De voorgestelde methode met kristalvioletkleuring duurt een totale tijd van 40 minuten om uit te voeren, met 15 minuten voor paraformaldehyde (PFA) incubatie, 5 minuten voor kristalviolette incubatie en maximaal 15 minuten voor materiaalvoorbereiding, bufferwassingen en drogen. Het immunocytochemische protocol dat wordt toegepast voor vergelijking duurt een gemiddelde tijd van 4 h 30 min en werd uitgevoerd zoals eerder beschreven9,10. De voorgestelde methode is bedoeld om een voltooide virale titratie te helpen visualiseren. Infectie- en incubatietijden kunnen worden uitgevoerd met verschillende lay-outs, afhankelijk van het virus. Hier testten we twee RNA-virussen met cytopathisch effect op cellijnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

Virale titratie is een belangrijke test voor virologisch onderzoek. De detectie van cytopathisch effect (CPE) via TCID50-assays en plaquevormende eenheden (PFU) -assays zijn de twee belangrijkste methoden om de titer van een virusvoorraad te berekenen en zijn vaak gebaseerd op microscopiedetectie of celkleuring voor visualisatie. In het geval van de TCID50-test is objectieve visualisatie gewoonlijk gebaseerd op immunocytochemische (ICC) kleuring van intracellulair virus om titers te berekenen in combinatie met visuele CPE-detectie via microscopie. ICC-kleuring is echter kostbaar en tijdrovend. In deze studie vergeleken we visuele CPE-observatie via microscopie, ICC-kleuring en kristalvioletkleuring om de titers van twee CPE-vormende virussen te bepalen, Influenza A-virus (IAV) van varkensoorsprong en Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-virus (PRRSV). We laten zien dat zowel kristalviolet- als ICC-kleuring nauwkeuriger zijn dan visuele CPE-detectie, met bijna identieke precisieniveaus op zowel IAV als PRRSV. Om deze reden presenteren we hier kristalvioletkleuring als een snellere en meer betaalbare manier om virale titraties te bepalen op een TCID50-test voor CPE-vormende virussen getitreerd in cellijnen.

De vergelijkingen die worden gebruikt voor het wiskundig berekenen van de titer werden eerder beschreven2,3.
Kortom, voor PRRSV passen we de Karber-methode toe:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 waarbij:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg">
In deze formule d = negatief logboek van de laatste verdunning met volledige po...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

Dit protocol toont een nauwkeurige en objectieve benadering om virale titraties te visualiseren met behulp van kristalviolet, door het te vergelijken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.

Gebruik van Kristalviolet om visueel cytopathisch effectgebaseerd lezen voor virale titratie te verbeteren met behulp van TCID50-testen

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

Het doel van dit protocol is om een virusvoorraadtitratie te produceren en deze te visualiseren met behulp van kristalvioletkleuring. Om dat te doen, zal een algemene virale titratie worden aangetoond, gevolgd door de kleuring. Deze titratie wordt uitgevoerd in een 96-well plaat gedurende een periode van zeven dagen in een bioveiligheidskast binnen een bioveiligheidsniveau 2 laboratorium.Om dit te doen, zal een 96-well plaat van de gewenste cellijn worden gezaaid met behulp van de overeenkomstige media en laten groeien tot confluent. De virusvoorraad wordt verdund met behulp van tienvoudige verdunningen, door 900 microliter media en 100 microliter virus te mengen, of de bijbehorende verdunning. Zorg ervoor dat u elke buis vortext om een goede menging van de media en het virus te garanderen en fouten in de verdunningen te voorkomen.Schrijf de lay-out van uw bord in het lood en elke verdunning om te helpen tijdens het infectieproces. Vóór infectie, wassen met 200 microliter PBS. Voeg 50 microliter van uw entmateriaal toe in de bijbehorende putjes.Incubeer vervolgens zeven dagen bij 37 graden celsius in een 5% CO2-incubator. Na de incubatie van zeven dagen, wassen met 200 microliter PBS. Fixeer de cellen door 50 microliter per put PFA toe te voegen bij 4% in PBS en incubaleer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Was de cellen na de incubatie nogmaals tweemaal met 200 microliter PBS voorafgaand aan de toevoeging van 50 microliter per put kristalviolet in water en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig ten slotte kristalviolet uit de putten en laat de platen optioneel twee tot vijf minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of was het met 200 microliter water om overmatige vlekken te verwijderen voordat u ze visualiseert. Als gevolg hiervan zullen negatieve cellen na het opnieuw kleuren worden gekleurd.Positieve putten zullen worden opgeruimd. Deze informatie wordt gebruikt in een van de twee beschreven formules om uw uiteindelijke virale titer te berekenen. Toen de titer die met elke methode werd verkregen, werd vergeleken, bleek dat in de monocytochemie kleuring in sommige gevallen extra positieve putten kon detecteren in vergelijking met kristalviolet, en dat beide kleuringsmethoden ook meer positieve putten konden detecteren dan visuele evaluatie via microscopie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...