Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Frank Scholle für seine hilfreichen Kommentare im Manuskript, Chloe Mariant für ihre Hilfe bei den Mikroskopiebildern und Teresa M. Tiedge für ihre hilfreiche englische Überarbeitung.

1. Titrationsprotokoll
HINWEIS: Verwenden Sie ein zytopathisches Virus, das adhärente Zellen infiziert. Für diesen Nachweis wurden das Influenza-A-Virus (IAV) schweineischen Ursprungs (A/California/07/2009/(H1N1)) und das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Typ 2, Stamm NC 1-7-4 verwendet.
<ol><li>Titrieren Sie diese Viren in 96 Vertiefungsplatten für 7 Tage in einer Biosicherheitswerkbank in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2).<ol>
<li>U...

<ol>
	<li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments.">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints.">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+right+and+wrong+cases+(constant+stimuli)+without+Gauss's+formulae.">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).</li><li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+assay+methods:+accuracy+and+validation.">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li><li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+virus+isolation,+polymerase+chain+reaction,+immunohistochemistry,+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs.">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li><li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effects+of+viruses+protocols.">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Y&#225;ng&#252;ez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influenza Virus. , 59-88 (2018).</li><li>Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV:+an+immunohistochemical+study.">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs.">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li><li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods.">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li></ol>

Virale Titrationen werden routinemäßig in der virologischen Forschung verwendet, wobei PFU-Nachweis und TCID50-Assays am häufigsten verwendet werden1,2,3,4. Beide Methoden beruhen auf dem Nachweis von CPE in infizierten Zellen, und obwohl sie visuell durch Mikroskopie beurteilt werden können, wird in der Regel eine Färbung angewendet, um ein objektiveres Ergebnis zu erhalten oder ...

Die virale Titration mittels TCID50-Assay ist eine häufig verwendete Technik in der Infektionsforschung1. Obwohl im Laufe der Zeit Variationen der Mathematik hinter dieser Methode vorgeschlagen wurden1,2,3,4, beruhen die derzeit angewandten Methoden des Infektionsnachweises auf der visuellen Bestätigung durch das Vorhandensein eines zytopathischen Effekts (CPE) unter Verwendung der Mikroskopie5. Um die CPE-Visualisierung objektiver auf TCID50-Assays zu bestätigen, ist die immunzytochemische (ICC) intrazelluläre Färbung, die auf die Proteine des Virus abzielt, eine der am häufigsten verwendeten Methoden6, da verschiedene Viren unterschiedliche Formen von CPE produzieren können. In unserem Fall sind die morphologischen Veränderungen der Zellen ähnlich, wenn sie sowohl mit dem Influenza-A-Virus (IAV) als auch mit dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) infiziert sind, bei dem sich infizierte Zellen zusammenballen und von der Platte lösen. Im Fall von PRRSV verursacht es eine CPE, die als "totale Zerstörung" bekannt ist, bei der sich alle Zellen vom Brunnen lösen. IAV hingegen kann sowohl eine totale Zerstörung als auch eine zusätzliche CPE darstellen, die als "subtotale Zerstörung" bekannt ist, bei der sich eine kleine Anzahl von Zellen nach der Infektion nicht löst7. Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und erfordert die Verwendung relativ kostspieliger Reagenzien. Es ist wichtig zu beachten, dass ICC nicht CPE kennzeichnet, sondern die Anzahl der Zellen, die erfolgreich mit dem Virus infiziert wurden. Dies bedeutet, dass die Zellen, die am Ende der Inkubation erfolgreich infiziert wurden, auch dann als positiv angesehen werden, wenn die Infektion cpe noch nicht verursacht hat, und somit ein höherer Prozentsatz an ICC-positiven Zellen im Vergleich zu CPE erwartet wird. Aus diesem Grund beschreiben wir in dieser Studie eine komplementäre Methode zum visuellen Nachweis von CPE in einem TCID50-Assay auf der Basis von Kristallviolett, einer Chemikalie mit einer positiven Ladung, die an Zellmembranen bindet und zur Färbung anhaftender Zellen verwendet wird. Kristallviolett wird häufig in der virologischen Forschung verwendet, um unter anderem plaquebildende Einheiten zu messen8.
In dieser Studie vergleichen wir die Sensitivität der nicht gefärbten Mikroskopie-CPE-Detektion mit der Kristallviolettfärbung und der immunzytochemischen Färbung basierend auf viraler Proteinerkennung, von der bekannt ist, dass sie aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit objektiver ist. Diese Studie zeigt, dass sowohl die kristallviolette als auch die immunzytochemische Färbung genauer sind als die visuelle mikroskopische CPE-Detektion und zur objektiven Identifizierung infizierter Vertiefungen in einer TCID50-Titration verwendet werden können. Angesichts ihrer Fähigkeit, ein nahezu identisches Maß an Genauigkeit bei den in Zelllinien getesteten zytopathischen Viren zu erreichen, wird Crystal Violet als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit zur Bestimmung von Virustitrationen auf einem TCID50-Assay präsentiert. Die vorgeschlagene Methode unter Verwendung der Kristallviolettfärbung benötigt eine Gesamtzeit von 40 minuten, mit 15 min für die Paraformaldehyd (PFA) -Inkubation, 5 min für die Kristallviolett-Inkubation und maximal 15 min für die Materialvorbereitung, Pufferwäsche und Trocknung. Das zum Vergleich verwendete immunzytochemische Protokoll dauert durchschnittlich 4 h 30 min und wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt9,10. Die vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, eine abgeschlossene virale Titration zu visualisieren. Infektions- und Inkubationszeiten können je nach Virus mit unterschiedlichem Layout durchgeführt werden. Hier haben wir zwei RNA-Viren mit zytopathischer Wirkung auf Zelllinien getestet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

Die virale Titration ist ein Schlüsseltest für die virologische Forschung. Der Nachweis des zytopathischen Effekts (CPE) über TCID50-Assays und Plaque-bildende Einheiten (PFU)-Assays sind die beiden Hauptmethoden zur Berechnung des Titers eines Virusbestandes und basieren häufig auf mikroskopischem Nachweis oder Zellfärbung zur Visualisierung. Im Falle des TCID50-Assays basiert die objektive Visualisierung üblicherweise auf der immunzytochemischen (ICC) Färbung des intrazellulären Virus, um Titer in Kombination mit visuellem CPE-Nachweis über die Mikroskopie zu berechnen. ICC-Färbungen sind jedoch kostspielig und zeitaufwendig. In dieser Studie verglichen wir die visuelle CPE-Beobachtung mittels Mikroskopie, ICC-Färbung und Kristallviolettfärbung, um die Titer von zwei CPE-bildenden Viren zu bestimmen, dem Influenza-A-Virus (IAV) schweineischen Ursprungs und dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). Wir zeigen, dass sowohl die Kristallviolett- als auch die ICC-Färbung genauer sind als die visuelle CPE-Detektion und sowohl bei IAV als auch bei PRRSV nahezu identisch genau sind. Aus diesem Grund präsentieren wir hier die Kristallviolettfärbung als eine schnellere und kostengünstigere Möglichkeit, virale Titrationen auf einem TCID50-Assay für CPE-bildende Viren zu bestimmen, die in Zelllinien titriert sind.

Die Gleichungen, die zur mathematischen Berechnung des Titers verwendet wurden, wurden zuvor beschrieben2,3.
Kurz gesagt, für PRRSV wenden wir die Karber-Methode an:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 wobei:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg">
In dieser Formel d = negatives Protokoll der letzten Verdünnung mit vollst...

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Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

Dieses Protokoll zeigt einen genauen und objektiven Ansatz zur Visualisierung viraler Titrationen unter Verwendung von Kristallviolett, indem es mit optischer Mikroskopie und immunzytochemischer Färbung verglichen wird.

Verwendung von Crystal Violet zur Verbesserung des visuellen zytopathischen Effekt-basierten Lesens für die virale Titration mit TCID50-Assays

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Virusbestandstitration zu erzeugen und sie durch Kristallviolettfärbung zu visualisieren. Dazu wird eine allgemeine virale Titration demonstriert, gefolgt von der Färbung. Diese Titration wird in einer 96-Well-Platte für einen Zeitraum von sieben Tagen in einer Biosicherheitswerkbank innerhalb eines Labors der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.Dazu wird eine 96-Well-Platte der bevorzugten Zelllinie unter Verwendung des entsprechenden Mediums ausgesät und bis zum Zusammenfluss wachsen lassen. Der Virusbestand wird mit zehnfachen Verdünnungen verdünnt, indem 900 Mikroliter Medien und 100 Mikroliter Virus oder die entsprechende Verdünnung gemischt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie jedes Röhrchen wirbeln, um eine ordnungsgemäße Vermischung des Mediums und des Virus zu gewährleisten und Fehler bei den Verdünnungen zu vermeiden.Schreiben Sie das Layout Ihrer Platte in den Lead sowie jede Verdünnung, um während des Infektionsprozesses zu helfen. Vor der Infektion mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter Ihres Inokulums in die entsprechenden Vertiefungen hinzu.Dann sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren. Nach der siebentägigen Inkubation mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung PFA bei 4% in PBS hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS waschen, bevor 50 Mikroliter pro Vertiefung Kristallviolett in Wasser zugegeben werden, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss Kristallviolett aus den Vertiefungen absaugen und optional die Platten zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen oder mit 200 Mikrolitern Wasser waschen, um übermäßige Flecken vor der Visualisierung zu entfernen. Infolgedessen werden nach der erneuten Färbung negative Zellen gefärbt.Positive Brunnen werden gerodet. Diese Informationen werden in einer der beiden beschriebenen Formeln verwendet, um Ihren endgültigen Virustiter zu berechnen. Wenn der mit jeder Methode erhaltene Titer verglichen wurde, zeigte sich, dass in der Monozytochemie die Färbung in einigen Fällen zusätzliche positive Vertiefungen im Vergleich zu Kristallviolett erkennen konnte, und dass beide Färbemethoden auch mehr positive Vertiefungen erkennen konnten als die visuelle Bewertung durch Mikroskopie.

Research

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Immunology and Infection

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Forschung

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