Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
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लेखक पांडुलिपि में अपनी सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ फ्रैंक शोले को स्वीकार करना चाहते हैं, माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ उनकी मदद के लिए क्लोई मैरिएंट और उनके सहायक अंग्रेजी संशोधन के लिए टेरेसा एम।

1. अनुमापन प्रोटोकॉल
नोट: अनुयायी कोशिकाओं को संक्रमित करने वाले साइटोपैथिक वायरस का उपयोग करें। इस प्रदर्शन के लिए, सूअर मूल के इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) (ए / कैलिफोर्निया / 07 / 2009 / (एच 1 एन 1...

<ol>
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वायरल अनुमापन नियमित रूप से वायरोलॉजी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, जिसमें PFU का पता लगाने और TCID50 assays सबसे अधिक उपयोग किया जाता है1,2,3,4। दोनों विधियां संक?...

TCID50 परख के माध्यम से वायरल अनुमापन संक्रामक रोग अनुसंधान 1 में एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। यद्यपि इस विधि के पीछे गणित पर विविधताओं को समय 1,2,3,4 के साथ प्रस्तावित किया गया है, संक्रमण का पता लगाने के वर्तमान में लागू तरीके माइक्रोस्कोपी 5 का उपयोग करके साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) की उपस्थिति के माध्यम से दृश्य पुष्टि पर निर्भर करते हैं। TCID50 assays पर CPE विज़ुअलाइज़ेशन की अधिक निष्पक्ष रूप से पुष्टि करने के लिए, वायरस के प्रोटीन को लक्षित करने वाले immunocytochemical (ICC) इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है क्योंकि विभिन्न वायरस सीपीई के अलग-अलग रूपों का उत्पादन कर सकते हैं। हमारे मामले में, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी) दोनों से संक्रमित होने पर सेल रूपात्मक परिवर्तन समान होते हैं, जहां संक्रमित कोशिकाएं प्लेट से गोल और अलग होती हैं। पीआरआरएसवी के मामले में, यह एक सीपीई का कारण बनता है जिसे "कुल विनाश" के रूप में जाना जाता है, जहां सभी कोशिकाएं कुएं से अलग हो जाती हैं। दूसरी ओर, आईएवी, कुल विनाश और एक अतिरिक्त सीपीई दोनों को पेश कर सकता है जिसे "उप-कुल विनाश" के रूप में जाना जाता है जहां कोशिकाओं की एक छोटी संख्या संक्रमण के बाद अलग नहीं होती है। हालांकि, यह तकनीक प्रदर्शन करने में समय लेने वाली है और अपेक्षाकृत महंगे अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आईसीसी सीपीई को लेबल नहीं करता है, बल्कि वायरस से सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की संख्या है। इसका तात्पर्य यह है कि इनक्यूबेशन के अंत तक सफलतापूर्वक संक्रमित होने वाली कोशिकाओं को सकारात्मक के रूप में देखा जाएगा, भले ही संक्रमण ने अभी तक सीपीई का कारण नहीं बनाया हो, और इस प्रकार, सीपीई की तुलना में आईसीसी सकारात्मक कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत होने की उम्मीद है। इस कारण से, इस अध्ययन में हम क्रिस्टल वायलेट के आधार पर एक TCID50 परख में सीपीई के दृश्य का पता लगाने की एक पूरक विधि का वर्णन करते हैं, एक सकारात्मक चार्ज के साथ एक रसायन जो सेल झिल्ली से जुड़ता है और अनुयायी कोशिकाओं को दागने के लिए उपयोग किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट का उपयोग अक्सर विषाणु विज्ञान अनुसंधान में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को मापने के लिए किया जाता है, दूसरों के बीच 8।
इस अध्ययन में, हम वायरल प्रोटीन मान्यता के आधार पर क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ गैर-दाग माइक्रोस्कोपी सीपीई का पता लगाने की संवेदनशीलता की तुलना करते हैं, जो इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण अधिक उद्देश्य माना जाता है। इस अध्ययन से पता चलता है कि क्रिस्टल वायलेट और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग दोनों दृश्य माइक्रोस्कोपी-आधारित सीपीई डिटेक्शन की तुलना में अधिक सटीक हैं और इसका उपयोग टीसीआईडी 50 अनुमापन में संक्रमित कुओं की निष्पक्ष पहचान करने के लिए किया जा सकता है। सेल लाइनों में परीक्षण किए गए साइटोपैथिक वायरस पर सटीकता के लगभग समान स्तर तक पहुंचने की उनकी क्षमता को देखते हुए, क्रिस्टल वायलेट को एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित करने के लिए एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग करने वाली प्रस्तावित विधि को प्रदर्शन करने में 40 मिनट का कुल समय लगता है, पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) इनक्यूबेशन के लिए 15 मिनट, क्रिस्टल वायलेट इनक्यूबेशन के लिए 5 मिनट और सामग्री तैयार करने, बफर धोने और सुखाने के लिए अधिकतम 15 मिनट। तुलना के लिए लागू इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल में 4 घंटे 30 मिनट का औसत समय लगता है और पहले वर्णित 9,10 के रूप में किया गया था। प्रस्तावित विधि का उद्देश्य एक पूर्ण वायरल अनुमापन की कल्पना करने में मदद करना है। संक्रमण और इनक्यूबेशन बार वायरस के आधार पर अलग-अलग लेआउट के साथ किया जा सकता है। यहां हमने सेल लाइनों पर साइटोपैथिक प्रभाव के साथ दो आरएनए वायरस का परीक्षण किया।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

वायरल अनुमापन विषाणु विज्ञान अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण परख है। TCID50 assays और पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PFU) assays के माध्यम से साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का पता लगाना वायरस स्टॉक के टिटर की गणना करने के लिए दो मुख्य तरीके हैं और अक्सर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोस्कोपी डिटेक्शन या सेल स्टेनिंग पर आधारित होते हैं। TCID50 परख के मामले में, उद्देश्य विज़ुअलाइज़ेशन आमतौर पर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य सीपीई का पता लगाने के साथ संयुक्त टिटर्स की गणना करने के लिए इंट्रासेल्युलर वायरस के immunocytochemical (आईसीसी) धुंधला पर आधारित है। हालांकि, आईसीसी धुंधला महंगा और समय लेने वाला है। इस अध्ययन में, हमने माइक्रोस्कोपी, आईसीसी स्टेनिंग और क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के माध्यम से दृश्य सीपीई अवलोकन की तुलना की ताकि दो सीपीई-बनाने वाले वायरस, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के टिटर्स को निर्धारित किया जा सके सूअर मूल और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी)। हम दिखाते हैं कि क्रिस्टल वायलेट और आईसीसी स्टेनिंग दोनों दृश्य सीपीई का पता लगाने की तुलना में अधिक सटीक हैं, जो आईएवी और पीआरआरएसवी दोनों पर परिशुद्धता के लगभग समान स्तर प्रस्तुत करते हैं। इस कारण से, यहां हम क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग को एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में पेश करते हैं ताकि सीपीई के लिए एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित किया जा सके- सेल लाइनों में titrated वायरस बनाने के लिए।

गणितीय रूप से टिटर की गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले समीकरणों को पहले 2,3 वर्णित किया गया था।
संक्षेप में, PRRSV के लिए, हम कारबर विधि लागू करते हैं:
टिटर (TCID50) = 10 T + 1.3</s...

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Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

यह प्रोटोकॉल क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके वायरल अनुमापन की कल्पना करने के लिए एक सटीक और उद्देश्य दृष्टिकोण दिखाता है, इसकी तुलना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ करके।

क्रिस्टल वायलेट का उपयोग दृश्य Cytopathic प्रभाव में सुधार करने के लिए-TCID50 Assays का उपयोग कर वायरल अनुमापन के लिए पठन आधारित

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक वायरस स्टॉक अनुमापन का उत्पादन करना और क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग करके इसकी कल्पना करना है। ऐसा करने के लिए, एक सामान्य वायरल अनुमापन का प्रदर्शन किया जाएगा जिसके बाद धुंधला हो जाएगा। यह अनुमापन एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला के भीतर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सात दिनों की अवधि के लिए एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में किया जाएगा।ऐसा करने के लिए, पसंदीदा सेल लाइन की एक 96-अच्छी तरह से प्लेट को संबंधित मीडिया का उपयोग करके सीड किया जाएगा और confluent तक बढ़ने दिया जाएगा। वायरस स्टॉक को दस गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करके पतला किया जाएगा, मीडिया के 900 माइक्रोलीटर और वायरस के 100 माइक्रोलीटर, या इसी कमजोर पड़ने के मिश्रण से। मीडिया और वायरस के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने और dilutions पर त्रुटियों से बचने के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर करने के लिए सुनिश्चित करें।लीड में अपनी प्लेट के लेआउट के साथ-साथ संक्रमण प्रक्रिया के दौरान मदद करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने को लिखें। संक्रमण से पहले, पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर का उपयोग करके धोएं। संबंधित कुओं में अपने इनोकुलम के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर, सात दिनों के लिए 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सात दिन के इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर का उपयोग करके धोएं। पीबीएस में 4% पर पीएफए के प्रति कुएं में 50 माइक्रोलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, पानी में क्रिस्टल वायलेट के प्रति कुएं में 50 माइक्रोलीटर के अलावा पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से दो बार धोएं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अंत में, कुओं से एस्पिरेट क्रिस्टल बैंगनी और वैकल्पिक रूप से, प्लेटों को कमरे के तापमान पर दो से पांच मिनट के लिए सूखने के लिए छोड़ दें या विज़ुअलाइज़ेशन से पहले अत्यधिक दाग को हटाने के लिए इसे 200 माइक्रोलीटर पानी से धोएं। नतीजतन, फिर से धुंधला होने के बाद, नकारात्मक कोशिकाओं को दाग दिया जाएगा।सकारात्मक कुओं को साफ किया जाएगा। इस जानकारी का उपयोग आपके अंतिम वायरल टिटर की गणना करने के लिए दो वर्णित सूत्रों में से एक में किया जाएगा। जब प्रत्येक विधि के साथ प्राप्त टिटर की तुलना की गई थी, तो यह दिखाया गया था कि मोनोसाइटो रसायन विज्ञान में धुंधला कुछ मामलों में क्रिस्टल वायलेट की तुलना में अतिरिक्त सकारात्मक कुओं का पता लगा सकता है, और इसी तरह, दोनों धुंधला विधियां माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य मूल्यांकन की तुलना में अधिक सकारात्मक कुओं का पता लगा सकती हैं।

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During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

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एक पैन वायरल माइक्रोएरे परख (Virochip) का प्रयोग वायरल रोगज़नक़ों के लिए नैदानिक ​​नमूनों स्क्रीन

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

सभी इन्फ्लुएंजा के मात्रात्मक विश्लेषण सरल स्लॉट ब्लाट Assays में एक वायरल Hemagglutinins और यूनिवर्सल एंटीबॉडी का उपयोग कर Neuraminidases प्रकार

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

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माइक्रोबियल स्रोत विशिष्ट मानव और पशु वायरस का उपयोग ट्रैकिंग के लिए लागत प्रभावी विधि

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