Name: use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Forfattere vil gjerne anerkjenne Dr. Frank Scholle for hans nyttige kommentarer i manuskriptet, Chloe Mariant for hennes hjelp med mikroskopibildene og Teresa M. Tiedge for hennes hjelpsomme engelske revisjon.

1. Titreringsprotokoll
MERK: Bruk et cytopatisk virus som infiserer tilhengerceller. For denne demonstrasjonen ble Influensa A Virus (IAV) av svineopprinnelse (A/California/07/2009/(H1N1)) og Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stamme NC 1-7-4 brukt.
<ol><li>Titrate disse virusene i 96 brønnplater i 7 dager i et biosikkerhetsskap som ligger i et Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.<ol>
<li>For å utføre disse titrasjonene, frø 96 brønnp...

<ol>
	<li>K&#228;rber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments.">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints.">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+right+and+wrong+cases+(constant+stimuli)+without+Gauss's+formulae.">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).</li><li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+assay+methods:+accuracy+and+validation.">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li><li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+virus+isolation,+polymerase+chain+reaction,+immunohistochemistry,+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs.">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li><li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytopathic+effects+of+viruses+protocols.">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li><li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Y&#225;ng&#252;ez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influenza Virus. , 59-88 (2018).</li><li>Tingstedt, J. -. E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV:+an+immunohistochemical+study.">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs.">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li><li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods.">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li></ol>

Virale titrasjoner brukes rutinemessig i virologiforskning, med PFU-deteksjon og TCID50-analyser som oftest brukes1,2,3,4. Begge metodene er avhengige av påvisning av CPE i infiserte celler, og selv om de kan vurderes visuelt via mikroskopi, brukes en farging vanligvis for å oppnå et mer objektivt resultat eller til og med redusere inkubasjonstider. Når det gjelder TCID50, er et av...

Viral titrering via TCID50-analyse er en vanlig brukt teknikk i forskning på smittsomme sykdommer1. Selv om variasjoner på matematikken bak denne metoden har blitt foreslått over tid1,2,3,4, er de for tiden anvendte metodene for infeksjonsdeteksjon avhengig av visuell bekreftelse gjennom tilstedeværelsen av cytopatisk effekt (CPE) ved hjelp av mikroskopi5. For å bekrefte CPE-visualisering mer objektivt på TCID50-analyser, er immunocytokjemisk (ICC) intracellulær farging rettet mot virusets proteiner en av de mest brukte metodene6, da forskjellige virus kan produsere forskjellige former for CPE. I vårt tilfelle er cellemorfologiske endringer like når de er smittet med både Influensa A-virus (IAV) og Porcine Reproduktivt og Respiratorisk syndrom Virus (PRRSV), hvor infiserte celler runder opp og løsner fra platen. Når det gjelder PRRSV, forårsaker det en CPE kjent som "total ødeleggelse", hvor alle celler ender opp med å løsne fra brønnen. IAV derimot, kan presentere både total ødeleggelse og en ekstra CPE kjent som "subtotal ødeleggelse" der et lite antall celler ikke løsner etter infeksjon7. Denne teknikken er imidlertid tidkrevende å utføre og krever bruk av relativt kostbare reagenser. Det er viktig å merke seg at ICC ikke merker CPE, men heller antall celler som er infisert av viruset. Dette innebærer at cellene som ble vellykket smittet ved slutten av inkubasjonen, vil bli sett på som positive selv om infeksjonen ikke har forårsaket CPE ennå, og dermed forventes en høyere prosentandel av ICC-positive celler sammenlignet med CPE. Av den grunn beskriver vi i denne studien en komplementær metode for visuell deteksjon av CPE i en TCID50-analyse basert på krystallfiolett, et kjemikalie med en positiv ladning som festes til cellemembraner og brukes til å fargelegge celler. Krystallfiolett brukes ofte i virologiforskning for å måle plakkdannende enheter, blant andre8.
I denne studien sammenligner vi følsomheten til ikke-farget mikroskopi CPE-deteksjon med krystallfiolett farging og immunocytokjemisk farging basert på viral proteingjenkjenning, som er kjent for å være mer objektiv på grunn av sin høye følsomhet. Denne studien viser at både krystallfiolett og immunocytokjemisk farging er mer nøyaktig enn visuell mikroskopibasert CPE-deteksjon og kan brukes til objektivt å identifisere infiserte brønner i en TCID50-titrering. Gitt deres evne til å nå nesten identisk nøyaktighetsnivå på de cytopatiske virusene som er testet i cellelinjer, presenteres krystallfiolett som en raskere og rimeligere måte å bestemme virale titrasjoner på en TCID50-analyse. Den foreslåtte metoden ved hjelp av krystallfiolett farging tar en total tid på 40 min å utføre, med 15 min for paraformaldehyd (PFA) inkubasjon, 5 min for krystallfiolett inkubasjon og maksimalt 15 min for materialforberedelse, buffervask og tørking. Immunocytokjemiprotokollen som brukes til sammenligning tar en gjennomsnittlig tid på 4 t 30 min og ble utført som tidligere beskrevet9,10. Metoden som foreslås tar sikte på å visualisere en fullført viral titrering. Infeksjons- og inkubasjonstider kan utføres med forskjellig layout avhengig av viruset. Her testet vi to RNA-virus med cytopatisk effekt på cellelinjer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Clear, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C581-25; C581-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Influenza Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-0344R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary PRRSV Antibody</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-10043R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAA1882014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondaty antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of crystal violet to improve visual cytopathic effect-based reading for viral titration using tcid50 assays

Viral titrering er en viktig analyse for virologiforskning. Påvisning av cytopatisk effekt (CPE) via TCID50-analyser og plakkdannende enheter (PFU) analyser er de to hovedmetodene for å beregne titeret til et viruslager og er ofte basert på mikroskopideteksjon eller cellefarging for visualisering. Ved TCID50-analyse er objektiv visualisering vanligvis basert på immunocytokjemisk (ICC) farging av intracellulært virus for å beregne titere kombinert med visuell CPE-deteksjon via mikroskopi. Imidlertid er ICC-farging kostbar og tidkrevende. I denne studien sammenlignet vi visuell CPE observasjon via mikroskopi, ICC farging og krystallfiolett farging for å bestemme titers av to CPE-forming virus, Influensa A virus (IAV) av svin opprinnelse og Porcine Reproduktiv og Respiratory Syndrome virus (PRRSV). Vi viser at både krystallfiolett og ICC-farging er mer nøyaktig enn visuell CPE-deteksjon, og presenterer nesten identiske presisjonsnivåer på både IAV og PRRSV. Av denne grunn presenterer vi her krystallfiolett farging som en raskere og rimeligere måte å bestemme virale titrasjoner på en TCID50-analyse for CPE-dannende virus titrert i cellelinjer.

Ligningene som ble brukt til matematisk beregning av titeret ble tidligere beskrevet2,3.
Kort sagt, for PRRSV bruker vi Karber-metoden:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 der:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg">
I denne formelen d = negativ logg over den siste fortynning med fullstendig positiv virusrespons: fem positi...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays at JoVE.com

Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

Denne protokollen viser en nøyaktig og objektiv tilnærming for å visualisere virale titrasjoner ved hjelp av krystallfiolett, ved å sammenligne den med optisk mikroskopi og immunocytokjemisk farging.

Bruk av krystallfiolett for å forbedre visuell cytopatisk effektbasert lesing for viral titrering ved hjelp av TCID50-analyser

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

Målet med denne protokollen er å produsere et virus lager titrering og visualisere den ved hjelp av krystallfiolett farging. For å gjøre det, vil en generell viral titrering bli demonstrert etterfulgt av fargingen. Denne titreringen vil bli utført i en 96-brønnsplate i en periode på syv dager i et biosikkerhetsskap innenfor et biosikkerhetsnivå 2-laboratorium.For å gjøre det, vil en 96-brønns plate av den foretrukne cellelinjen bli sådd ved hjelp av tilsvarende medier og la vokse til sammenløpet. Virusbestanden vil bli fortynnet ved hjelp av ti ganger fortynning, ved å blande 900 mikroliter medier og 100 mikroliter virus, eller tilsvarende fortynning. Sørg for å virvel hvert rør for å sikre riktig blanding av mediet og viruset og unngå feil på fortynning.Skriv utformingen av platen din i ledningen, så vel som hver fortynning for å hjelpe under infeksjonsprosessen. Før infeksjon, vask med 200 mikroliter PBS. Tilsett 50 mikroliter av inokulumet i de tilsvarende brønnene.Deretter inkuberer du ved 37 grader celsius i en 5% CO2-inkubator i syv dager. Etter syv dagers inkubasjon, vask med 200 mikroliter PBS. Fest cellene ved å legge til 50 mikroliter per brønn med PFA ved 4% i PBS og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur.Etter inkubasjon, vask celler igjen to ganger med 200 mikroliter PBS før tilsetning av 50 mikroliter per krystallfiolett brønn i vann og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Til slutt, aspirert krystallfiolett fra brønnene og eventuelt, la platene lufttørke i to til fem minutter ved romtemperatur eller vask den med 200 mikroliter vann for å fjerne overdreven flekk før visualisering. Som et resultat, etter re-farging, vil negative celler bli farget.Positive brønner vil bli ryddet. Denne informasjonen vil bli brukt i en av de to beskrevne formlene for å beregne din endelige virale titer. Når titeret oppnådd med hver metode ble sammenlignet, viste det at i monocytokjemi farging i noen tilfeller kunne oppdage ytterligere positive brønner i forhold til krystallfiolett, og det samme kunne begge fargingsmetodene oppdage mer positive brønner enn visuell evaluering via mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kostnadseffektiv metode for mikrobiell kilde Tracking med bestemte mennesker og dyr virus

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Vurdere Nedsatt Metabolske endringer under Progressive Colonization of Germ-free Mouse av 1 H NMR spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Ved hjelp Klikk kjemi å måle effekten av virusinfeksjon på Host-Cell RNA syntese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Konsentrasjon Bestemmelse Gjennom platebedømmelser: Ved hjelp av tradisjonelle og Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidlig Viral Entry Analyser for identifisering og evaluering av Antiviral Forbindelser

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...