6.8K Views
•
10:57 min
•
April 22nd, 2022
DOI :
April 22nd, 2022
•0:15
Introduction
1:41
Days 0-2: Aseptic Culture Preparation for Biofilm Group
2:05
Day 2: Preparation and Inoculation of Deep Well Biofilm Plates
3:08
Day 3, Part 1: Biofilm Biomass Determination from Device Using CV Staining
4:10
Day 3, Part 2: Challenging Biofilms with Antimicrobial to Calculate Their 24 Hour Antimicrobial MBEC Value
4:54
Day 4: Recovery of Biofilm Biomass from Pegged Lids and Day 5: Determination of Device MBEC Values
5:44
Representative Results
9:07
Conclusion
Transcript
इस प्रक्रिया का लक्ष्य क्रिस्टल वायलेट धुंधला और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के माध्यम से एक पॉलीप्रोपाइलीन गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस के लिए मानक खूंटी ढक्कन बायोफिल्म डिवाइस की तुलना करना है। एक मानक खूंटी ढक्कन बायोफिल्म डिवाइस में 96 खूंटे होते हैं और उच्च थ्रूपुट बायोफिल्म प्रयोगों की अनुमति देने वाले मानक 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के शीर्ष पर फिट बैठता है। खूंटी ढक्कन बायोफिल्म विकास के लिए एक सतह प्रदान करता है और खूंटे पर उगाए गए बायोफिल्म्स को डाउनस्ट्रीम प्रयोगों में आगे विश्लेषण किया जा सकता है।
हालांकि, प्लेटें 200 माइक्रोलीटर की अधिकतम मात्रा का उपयोग करती हैं, जिससे बायोफिल्म गठन और बायोमास का अध्ययन करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है जो बायोफिल्म की अधिक मात्रा की मांग करने वाले प्रयोगों का उपयोग करते हैं। यहां, हम स्थैतिक बायोफिल्म्स को बढ़ाने के लिए गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस का वर्णन करते हैं। डीप वेल बायोफिल्म डिवाइस एक 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करता है जो खूंटी के ढक्कन के रूप में अर्ध-स्कर्ट 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के साथ फिट होता है।
यह विधि 750 माइक्रोलीटर की अधिकतम प्लेट मात्रा के लिए अनुमति देती है, बायोफिल्म विकास के लिए अधिक खूंटी सतह क्षेत्र प्रदान करती है, और मानक बायोफिल्म डिवाइस की तुलना में लागत में कम है। हम बायोफिल्म बायोमास को निर्धारित करने के लिए बायोफिल्म के क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन और तुलना करेंगे, साथ ही साथ न्यूनतम बायोफिल्म उन्मूलन एकाग्रता का निर्धारण, जिसे एमबीईसी के रूप में भी जाना जाता है। दिखाया गया प्रयोग है कि वर्णित किया जाएगा का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन है।
लकीर एक cryopreserved स्टॉक से बैक्टीरिया उपभेदों को सीधे एक पोषक तत्व आगर प्लेट पर वांछित. इष्टतम तनाव की स्थिति के साथ रात भर आगर प्लेटों incubate. अगले दिन, विकास मीडिया के पांच मिलीलीटर में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाएं और रात भर एक इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को विकसित करें।
बायोफिल्म प्लेटों को दिखाया गया है के रूप में भरा जाएगा। बाँझ विकास मीडिया के 750 माइक्रोलीटर के साथ बाहरी कुओं को बाँझ पानी और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के 750 माइक्रोलीटर के साथ भरें। बाँझ विकास मीडिया के 675 माइक्रोलीटर के साथ शेष कुओं को भरें।
1.0 के 600 नैनोमीटर पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए रातभर संस्कृतियों को मानकीकृत करें। एक दस गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाएँ जब तक कि एक 10 करने के लिए माइनस तीन कमजोर पड़ने तक पहुँच गया है। 10 से माइनस तीन पतला संस्कृति के साथ मीडिया कुओं को 10 से माइनस चार और 750 माइक्रोलीटर की अंतिम कुल इन-वेल वॉल्यूम के लिए अंतिम कुल इन-वेल वॉल्यूम के लिए टीका लगाएं।
ध्यान से बायोफिल्म प्लेट में खूंटी ढक्कन डालें। 24 घंटे के लिए 160 आरपीएम के अधिकतम मिलाते हुए के साथ इष्टतम तनाव की स्थिति में प्लेटों को इनक्यूबेट करें। ध्यान से biofilm विकास प्लेट से खूंटी ढक्कन को हटाने और अच्छी तरह से प्रति बाँझ PBS के 800 microliters के साथ भरा एक नई गहरी अच्छी तरह से प्लेट में biofilms कुल्ला.
खूंटी ढक्कन को एक नई गहरी अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें वॉल्यूम क्रिस्टल वायलेट द्वारा 0.1% वजन के प्रति 800 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से शामिल हैं और पांच मिनट के लिए दाग लगाने की अनुमति देते हैं। अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए पीबीएस से भरे एक ताजा गहरे कुएं की प्लेट में ढक्कन को फिर से कुल्ला करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में 10 मिनट के लिए ढक्कन को सूखने की अनुमति देने के बाद, पांच मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से 30% तपस्वी एसिड के 800 माइक्रोलीटर से भरे एक गहरे कुएं की प्लेट में खूंटे को डेस्टेन करें।
खूंटी ढक्कन निकालें और समान रूप से दाग वितरित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करें। एक मानक 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस से 200 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें और 550 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें। रोगाणुरोधी चुनौती प्लेटों को दिखाया गया है के रूप में तैयार किया जाएगा।
बाहरी कुओं को बाँझ पानी के 750 माइक्रोलीटर और विकास मीडिया के 750 माइक्रोलीटर के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं से भरें। वांछित रोगाणुरोधी कमजोर पड़ने श्रृंखला के 750 माइक्रोलीटर के साथ शेष कुओं को भरें। ध्यान से डिवाइस से खूंटी ढक्कन को हटाने और पीबीएस के प्रति अच्छी तरह से 800 microliters के साथ एक बाँझ गहरी अच्छी तरह से प्लेट में कुल्ला।
रोगाणुरोधी चुनौती प्लेट के लिए खूंटी ढक्कन हस्तांतरण और वांछित जोखिम समय सीमा के लिए ऊष्मायन. Aseptically रोगाणुरोधी जोखिम प्लेट से खूंटी ढक्कन को हटाने और एक बाँझ गहरी अच्छी तरह से PBS से भरा प्लेट में कुल्ला. पीबीएस से खूंटी ढक्कन निकालें और अच्छी तरह से प्रति वसूली मीडिया के 750 microliters युक्त एक नई गहरी अच्छी तरह से प्लेट के लिए स्थानांतरण।
30 मिनट के लिए एक sonicating पानी के स्नान में प्लेट sonicate. खूंटी ढक्कन निकालें और संदूषण से बचने के लिए एक मानक गैर-पेग फ्लैट टॉप माइक्रोटिटर प्लेट ढक्कन के साथ बदलें। रात भर इष्टतम तनाव की स्थिति में इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, गहरी अच्छी तरह से प्लेट से 200 माइक्रोलीटर को एक मानक माइक्रोटिटर प्लेट में स्थानांतरित करें और 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें। क्रिस्टल वायलेट धुंधला जीवाणु biofilms के बायोमास approximating की एक प्रभावी और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है. मानक और गहरी अच्छी तरह से उपकरणों के क्रिस्टल वायलेट धुंधला से पता चला है कि दोनों जीवाणु प्रजातियों ने मानक डिवाइस की तुलना में गहरे अच्छी तरह से डिवाइस पर काफी अधिक बायोमास उगाया, जिसमें एस्चेरिचिया कोलाई मानक बायोफिल्म डिवाइस की तुलना में 2.1-गुना अधिक बायोमास बना रहा था और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा 4.1 गुना अधिक बायोमास बना रहा था।
ये परिणाम हमारी परिकल्पना के अनुरूप थे कि गहरे अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस के बढ़े हुए सतह क्षेत्र में वृद्धि हुई बायोमास संचय के लिए अनुमति होगी। गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पर बढ़ने वाले दोनों उपभेदों के लिए तकनीकी प्रतिकृति सीवी-दाग मूल्यों में अधिक परिवर्तनशीलता के बावजूद, या तो प्रजातियों के जैविक प्रतिकृति के लिए कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर जोड़ी-वार दो-तरफ़ा एनोवा या छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके नोट नहीं किया गया था, जिसमें पी मान 0.05 से अधिक थे। इस खोज से पता चलता है कि गहरी अच्छी तरह से उपकरणों द्वारा बायोफिल्म गठन मानक उपकरणों के समान पुनरुत्पादक बायोफिल्म बनाते हैं।
मानक और गहरी अच्छी तरह से उपकरणों के बीच मात्रा और खूंटी सतह क्षेत्र के लिए बायोफिल्म बायोमास को मानकीकृत करने के बाद हमारे परिणामों ने परीक्षण किए गए दो जीवाणु प्रजातियों के बीच एक मामूली लेकिन महत्वपूर्ण सामग्री वरीयता का संकेत दिया। पॉलीप्रोपाइलीन गहरी अच्छी तरह से डिवाइस पर, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा ने बायोमास गठन में 1.4 गुना सापेक्ष वृद्धि का प्रदर्शन किया और एस्चेरिचिया कोलाई ने पॉलीस्टीरीन मानक डिवाइस पर देखे गए व्युत्क्रम प्रभाव के साथ बायोमास गठन में 1.52 गुना सापेक्ष कमी का प्रदर्शन किया। बायोफिल्म डिवाइस खूंटी सामग्री के लिए जीवाणु प्रजातियों की वरीयता में यह अंतर इंगित करता है कि परिणामों को बायोफिल्म उपकरणों के बीच क्रॉस-तुलना नहीं की जा सकती है।
24 घंटे के बायोफिल्म्स की रोगाणुरोधी चुनौती का परीक्षण चतुर्भुज अमोनियम यौगिक बेंजाल्कोनियम क्लोराइड का उपयोग करके किया गया था, जिसे बैक्टीरियल बायोफिल्म गठन का एक प्रभावी अवरोधक माना जाता है, लेकिन बायोफिल्म उन्मूलन के लिए एक कम प्रभावी रोगाणुरोधी। हमारे परिणामों से पता चला है कि गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस से प्राप्त BZK BMEC मूल्यों में औसतन Escherichia coli के लिए छह गुना और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए आठ गुना की वृद्धि हुई है जब मानक बायोफिल्म डिवाइस पर विकास की तुलना में। BZK MBEC परिणाम अधिक परिवर्तनशील थे क्योंकि यह बायोफिल्म उन्मूलन के लिए एक कम प्रभावी रोगाणुरोधी है और इसके परिणामस्वरूप दोनों उपकरणों पर एस्चेरिचिया कोलाई एमबीईसी मूल्यों के लिए एक सीमा होती है, जो कुछ बाहरी बायोफिल्म खूंटे के कारण होती है जो उच्च सांद्रता में बच जाती है।
हमने कीटाणुनाशक ब्लीच की भी तुलना की, जिसे बैक्टीरियल बायोफिल्म उन्मूलन के लिए एक बहुत ही प्रभावी रोगाणुरोधी माना जाता है। ब्लीच ने दोनों प्रजातियों के लिए गहरे कुएं के उपकरण की तुलना में मानक डिवाइस में परीक्षण किए जाने पर थोड़ा अधिक एमबीईसी मूल्य का प्रदर्शन किया, जिससे एस्चेरिचिया कोलाई में चार गुना वृद्धि हुई और क्रमशः स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में दोगुनी वृद्धि हुई। हालांकि, ये अंतर उपकरणों के बीच पुनरुत्पादक त्रुटि की सीमा के भीतर थे और बीजेडके की तुलना में बहुत कम परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया, बायोफिल्म उन्मूलन के लिए अधिक प्रभावी रोगाणुरोधी के रूप में ब्लीच की पुष्टि की।
प्रत्येक बायोफिल्म डिवाइस की एक प्रमुख सीमा खूंटे की अलग-अलग प्लास्टिक संरचना और इन सतहों पर विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के पालन और बायोमास गठन में परिणामी परिवर्तनशीलता होगी। इसके अतिरिक्त, विभिन्न रोगाणुरोधी और प्लास्टिक खूंटी सामग्री के बीच रासायनिक बातचीत और compatibilities वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए। अंत में, इस प्रोटोकॉल और गहरी अच्छी तरह से और मानक biofilm उपकरणों पर हमारे बायोमास तुलना से निष्कर्ष ों से पता चलता है कि दोनों मजबूत Escherichia कोलाई और स्यूडोमोनास aeruginosa biofilms गहरी अच्छी तरह से उपकरण के साथ खेती करने में सक्षम हैं मानक डिवाइस की तुलना में काफी अधिक बायोमास प्रति खूंटी सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं।
गहरी अच्छी तरह से बायोफिल्म डिवाइस स्थैतिक, उच्च थ्रूपुट बायोफिल्म खेती और स्क्रीनिंग अध्ययनों के लिए एक व्यवहार्य, सस्ती विकल्प प्रदान करता है जिसके लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए बड़ी मात्रा में बायोफिल्म की आवश्यकता होती है। प्रत्येक डिवाइस के बीच प्लास्टिक सामग्री रचनाओं में अंतर के कारण, सीवी-दाग बायोफिल्म बायोमास और एमबीईसी मूल्यों की तुलना सीधे उपकरणों के बीच नहीं की जा सकती है। हालांकि, यदि प्रयोगों को लगातार एक ही डिवाइस पर आयोजित किया जाता है, तो आइसोलेट्स और एंटीमाइक्रोबियल्स के बीच प्राप्त परिणाम तुलनीय हैं।
गहरी अच्छी तरह से biofilm डिवाइस प्रयोगशालाओं है कि कम लागत वाली सामग्री का उपयोग कर उच्च throughput assays में biofilms का अध्ययन करना चाहते हैं के लिए सिफारिश की है.
यह प्रोटोकॉल बायोफिल्म विकास और बायोमास माप करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट 96-अच्छी तरह से पेग किए गए ढक्कन स्थैतिक बायोफिल्म स्क्रीनिंग के लिए स्व-इकट्ठा गहरी अच्छी तरह से पीसीआर-प्लेट उपकरणों का उपयोग किया जाता है।
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved