Generering af større bakteriel biofilmbiomasse ved hjælp af PCR-plade deep well mikropladeenheder

Målet med denne procedure er at sammenligne standardpind låg biofilm enhed til en polypropylen dyb brønd biofilm enhed gennem krystal violet farvning og antimikrobiel modtagelighed test. En standard peg låg biofilm enhed har 96 pinde og passer oven på en standard 96-brønds mikrotiter plade, der giver mulighed for biofilm eksperimenter med høj gennemstrømning. Pløklåget giver en overflade til biofilmvækst, og biofilm dyrket på pløkkerne kan analyseres yderligere i nedstrømsforsøg.

Pladerne bruger dog et maksimalt volumen på 200 mikroliter, hvilket gør det mere udfordrende at studere biofilmdannelse og biomasse ved hjælp af eksperimenter, der kræver større mængder biofilm. Her beskriver vi den dybe brøndbiofilmenhed til dyrkning af statiske biofilm. Den dybe brøndbiofilmenhed bruger en 96-brønd dyb brøndmikrotiterplade udstyret med en halvskørtet 96-brønds PCR-plade som pindelåg.

Denne metode giver mulighed for et maksimalt pladevolumen på 750 mikroliter, giver mere pindeoverfladeareal til biofilmvækst og er lavere i omkostninger sammenlignet med standard biofilmenheden. Vi vil beskrive og sammenligne protokollerne for krystalviolet farvning af biofilm til bestemmelse af biofilmbiomasse samt bestemmelse af den mindste koncentration af udryddelse af biofilm, også kendt som MBEC. Vist er en skematisk oversigt over eksperimentet, der vil blive beskrevet.

Streak ønskede bakteriestammer fra en kryokonserveret bestand direkte på en næringsstof agar plade. Inkuber agarplader natten over med optimale belastningsforhold. Den følgende dag podes en enkelt koloni i fem milliliter vækstmedier og dyrker kulturer i en inkubator natten over.

Biofilmpladerne fyldes som vist. Fyld de ydre brønde med 750 mikroliter sterilt vand og negative kontrolbrønde med 750 mikroliter sterile vækstmedier. Fyld de resterende brønde med 675 mikroliter sterile vækstmedier.

Standardiser kulturer natten over til en optisk densitet på 600 nanometer på 1,0. Opret en tidobbelt fortyndingsserie, indtil en 10 til minus tre fortynding er nået. Inokulære mediebrønde med 10 til minus tre fortyndet kultur til en endelig bakteriel fortynding på 10 til minus fire og endeligt samlet in-well volumen på 750 mikroliter.

Indsæt forsigtigt pindelåget i biofilmpladen. Inkuber plader under optimale belastningsforhold med maksimal omrystning på 160 rpm i 24 timer. Fjern forsigtigt pløklåget fra biofilmens vækstplade, og skyl biofilmene i en ny dyb brøndplade fyldt med 800 mikroliter steril PBS pr. Brønd.

Overfør pløklågene til en ny dyb brøndplade indeholdende 800 mikroliter pr. Brønd på 0,1% vægt efter volumen krystalviolet og lad det plette i fem minutter. Skyl lågene igen i en frisk dyb brøndplade fyldt med PBS for at fjerne overskydende pletter. Efter at have ladet lågene tørre i 10 minutter i et biosikkerhedsskab, skal du afspærre stifterne i en dyb brøndplade fyldt med 800 mikroliter 30% asketinsyre pr. Brønd i fem minutter.

Fjern pindelåget og bland grundigt for jævnt at fordele pletten. Overfør 200 mikroliter fra den dybe brøndbiofilmenhed til en standard 96-brønds mikrotiterplade, og læs den optiske densitet ved 550 nanometer. De antimikrobielle udfordringsplader vil blive udarbejdet som vist.

Fyld de ydre brønde med 750 mikroliter sterilt vand og de positive og negative kontrolbrønde med 750 mikroliter vækstmedier. Fyld de resterende brønde med 750 mikroliter af den ønskede antimikrobielle fortyndingsserie. Fjern forsigtigt pindelåget fra enheden, og skyl i en steril dyb brøndplade med 800 mikroliter pr. Brønd PBS.

Overfør pløklåget til den antimikrobielle udfordringsplade, og inkuber for den ønskede eksponeringstidsramme. Fjern aseptisk pindelåg fra den antimikrobielle eksponeringsplade og skyl i en steril dyb brønd PBS-fyldt plade. Fjern pløklåget fra PBS'en, og overfør til en ny dyb brøndplade, der indeholder 750 mikroliter genvindingsmedier pr. Brønd.

Sonikere pladen i et sonikerende vandbad i 30 minutter. Fjern pløklåget, og udskift det med et standard ikke-fastgjort fladt mikrotiterpladelåg for at undgå forurening. Inkuber ved optimale belastningsforhold natten over.

Den følgende dag overføres 200 mikroliter fra den dybe brøndplade til en standard mikrotiterplade og læses den optiske densitet ved 600 nanometer. Krystalviolet farvning er en effektiv og meget anvendt metode til tilnærmelse af biomassen af bakterielle biofilm. Krystalviolet farvning af standard- og dybbrøndeenhederne viste, at begge bakteriearter voksede betydeligt mere biomasse på den dybe brøndanordning sammenlignet med standardanordningen med Escherichia coli, der dannede 2,1 gange mere biomasse sammenlignet med standard biofilmenheden og Pseudomonas aeruginosa, der dannede 4,1 gange mere biomasse.

Disse resultater var i overensstemmelse med vores hypotese om, at det øgede overfladeareal af den dybe brøndbiofilmanordning ville muliggøre øget biomasseakkumulering. På trods af større variation i tekniske replikerede CV-farvede værdier for begge stammer, der vokser på den dybe brøndenhed, blev der ikke konstateret statistisk signifikante forskelle for nogen af arternes biologiske replikater ved hjælp af parvis tovejs ANOVA eller elevens T-test med P-værdier, der var større end 0,05. Dette fund viser, at biofilmdannelsen ved hjælp af dybe brøndanordninger danner reproducerbare biofilm svarende til standardenheder.

Vores resultater efter standardisering af biofilmbiomasse for volumen og pløkoverfladeareal mellem standard- og dybbrøndeenhederne indikerede en lille, men signifikant materialepræference mellem de to testede bakteriearter. På polypropylen dyb brøndanordningen viste Pseudomonas aeruginosa en 1,4 gange relativ stigning i biomassedannelsen, og Escherichia coli demonstrerede et 1,52 gange relativt fald i biomassedannelsen med den omvendte virkning, der blev observeret på polystyrenstandardanordningen. Denne forskel i bakterieartspræference for biofilmenhedspindmateriale indikerer, at resultaterne ikke kan krydssammenlignes mellem biofilmenheder.

Antimikrobiel udfordring af 24-timers biofilm blev testet ved hjælp af den kvaternære ammoniumforbindelse benzalkoniumchlorid, som er kendt for at være en effektiv hæmmer af bakteriel biofilmdannelse, men et mindre effektivt antimikrobielt middel til udryddelse af biofilm. Vores resultater viste, at BZK BMEC-værdier opnået fra biofilmenheden med dyb brønd steg med et gennemsnit seks gange for Escherichia coli og otte gange for Pseudomonas aeruginosa sammenlignet med væksten på standard biofilmenheden. BZK MBEC-resultaterne var mere variable som forventet, da det er et mindre effektivt antimikrobielt middel til udryddelse af biofilm og resulterede i en række Escherichia coli MBEC-værdier på begge enheder på grund af et par outlier biofilmpinde, der overlevede ved højere koncentrationer.

Vi sammenlignede også desinfektionsmidlet blegemiddel, som er kendt for at være et meget effektivt antimikrobielt middel til udryddelse af bakteriel biofilm. Blegemiddel viste en lidt højere MBEC-værdi, når den blev testet i standardenheden sammenlignet med den dybe brøndanordning for begge arter, hvilket førte til henholdsvis en firedobling af Escherichia coli og en dobbelt stigning i Pseudomonas aeruginosa. Disse forskelle var imidlertid inden for området for reproducerbare fejl mellem enheder og viste meget mindre variabilitet end BZK, hvilket bekræftede blegemiddel som et mere effektivt antimikrobielt middel til udryddelse af biofilm.

En væsentlig begrænsning for hver biofilmanordning ville være den forskellige plastsammensætning af pløkkerne og den deraf følgende variabilitet i vedhæftning og biomassedannelse af forskellige bakteriearter til disse overflader. Derudover skal kemiske interaktioner og kompatibilitet mellem forskellige antimikrobielle stoffer og plastpindmaterialet tages i betragtning, inden den beskrevne protokol udføres. Afslutningsvis viser denne protokol og resultaterne fra vores biomassesammenligninger på dybbrønden og standard biofilmenheder, at begge er i stand til at dyrke robuste Escherichia coli- og Pseudomonas aeruginosa-biofilm med den dybe brøndanordning, der giver betydeligt mere biomasse pr. Pindoverfladeareal end standardenheden.

Den dybe brønd biofilm enhed tilbyder et levedygtigt, overkommeligt alternativ til statisk, høj gennemstrømning biofilm dyrkning og screening undersøgelser, der kræver større mængder biofilm til downstream analyse. På grund af forskellene i plastmaterialesammensætninger mellem hver enhed kan de CV-farvede biofilmbiomasse- og MBEC-værdier ikke sammenlignes direkte mellem enheder. Hvis forsøg udføres konsekvent på det samme udstyr, er resultaterne mellem isolater og antimikrobielle stoffer imidlertid sammenlignelige.

Den dybe brøndbiofilmenhed anbefales til laboratorier, der gerne vil studere biofilm i assays med høj gennemstrømning ved hjælp af billige materialer.