ייצור ביופילם ביומסה חיידקית גדולה יותר באמצעות מכשירי מיקרופלאט עמוק באר עמוקה צלחת PCR

מטרתו של הליך זה היא להשוות את התקן הביופילם הסטנדרטי למכסה היתד למכשיר ביופילם עמוק היטב פוליפרופילן באמצעות כתמים סגול קריסטל ובדיקות רגישות מיקרוביאלית. התקן ביופילם מכסה יתד סטנדרטי כולל 96 יתדות ומתאים על גבי צלחת מיקרופיטר סטנדרטית של 96 well המאפשרת ניסויים ביופילם בתפוקה גבוהה. מכסה היתד מספק משטח לצמיחת ביופילם וניתן לנתח עוד יותר את הביופילמים הגדלים על היתדות בניסויים במורד הזרם.

עם זאת, הלוחות משתמשים בנפח מרבי של 200 מיקרוליטרים מה שהופך אותו למאתגר יותר לחקור היווצרות ביופילם וביומסה באמצעות ניסויים הדורשים כמויות גדולות יותר של ביופילם. כאן, אנו מתארים את התקן הביופילם בבאר העמוקה לגידול ביופילמים סטטיים. התקן הביופילם העמוק משתמש בלוח מיקרוטיטר עמוק בעומק 96 היטב המצויד בלוח PCR 96-well חצאית למחצה כמכסה היתד.

שיטה זו מאפשרת נפח צלחת מקסימלי של 750 מיקרוליטר, מספקת שטח פנים יתד יותר לצמיחת ביופילם, והיא נמוכה יותר בעלות בהשוואה למכשיר הביופילם הסטנדרטי. אנו נתאר ונשווה את הפרוטוקולים להכתמה סגולה קריסטלית של ביופילמים כדי לקבוע ביופילם ביומסה, כמו גם קביעת ריכוז השמדת הביופילם המינימלי, הידוע גם בשם MBEC. מוצגת סקירה סכמטית של הניסוי שיתואר.

פסים רצו זני חיידקים רצויים ממלאי קריופ שמור ישירות על צלחת אגר מזין. צלחות אגר דגירה לילה עם תנאי מאמץ אופטימליים. למחרת, לחסן מושבה אחת בחמישה מיליליטרים של תקשורת צמיחה ולגדל תרבויות בחממה בן לילה.

לוחות הביופילם יתמלאו כפי שמוצג. מלאו את הבארות החיצוניות ב-750 מיקרוליטרים של מים סטריליים ובארות בקרה שליליות ב-750 מיקרוליטרים של מדיית צמיחה סטרילית. מלאו את הבארות הנותרות ב-675 מיקרוליטרים של מדיה סטרילית לצמיחה.

סטנדרטיזציה של תרביות לילה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 1.0. צור סדרת דילול של פי עשרה עד להגעה לדילול של 10 עד מינוס שלוש. לחסן בארות מדיה עם 10 עד מינוס שלוש תרבות מדוללת עבור דילול חיידקי סופי של 10 עד מינוס ארבע ונפח הכולל הסופי של 750 מיקרוליטרים.

הכנס בזהירות את מכסה היתד לצלחת הביופילם. לוחות דגירה בתנאי מאמץ אופטימליים עם רעד מרבי של 160 סל"ד למשך 24 שעות. הסר בזהירות את מכסה היתד מצלחת הצמיחה של הביופילם ושטוף את הביופילמים בצלחת באר עמוקה חדשה מלאה ב-800 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לבאר.

מעבירים את מכסי היתד לצלחת באר עמוקה חדשה המכילה 800 מיקרוליטרים לבאר במשקל של 0.1% משקל על ידי סגול קריסטל נפח ומאפשרים להכתים במשך חמש דקות. יש לשטוף שוב את המכסים בצלחת באר עמוקה ורעננה מלאה ב-PBS להסרת כתם עודף. לאחר מתן המכסים להתייבש במשך 10 דקות בארון בטיחות ביולוגית, destain את היתדות בצלחת באר עמוקה מלא 800 microliters של 30% חומצה סגפנית לבאר במשך חמש דקות.

מוציאים את מכסה היתד ומערבבים היטב כדי להפיץ באופן שווה את הכתם. העבר 200 מיקרוליטרים מהתקן הביופילם של הבאר העמוקה ללוח מיקרוטיטר סטנדרטי של 96 בארות וקרא את הצפיפות האופטית ב-550 ננומטר. לוחות האתגר האנטי-מיקרוביאליים יהיו מוכנים כפי שמוצג.

מלאו את הבארות החיצוניות ב-750 מיקרוליטרים של מים סטריליים ובבארות השליטה החיוביות והשליליות ב-750 מיקרוליטרים של מדיית צמיחה. מלאו את הבארות הנותרות ב-750 מיקרוליטרים מסדרת הדילול האנטי-מיקרוביאלית הרצויה. הסר בזהירות את מכסה היתד מהמכשיר ושטוף בצלחת באר עמוקה סטרילית עם 800 מיקרוליטרים לבאר של PBS.

מעבירים את מכסה היתד לצלחת האתגר האנטי-מיקרוביאלית ודוללים למסגרת זמן החשיפה הרצויה. הסר באופן אספטי את מכסי היתד מלוחית החשיפה האנטי-מיקרוביאלית ושטוף בצלחת סטרילית עמוקה ומלאת PBS. הסר את מכסה היתד מה- PBS והעבר לצלחת באר עמוקה חדשה המכילה 750 מיקרוליטרים של מדיית התאוששות לבאר.

Sonicate הצלחת באמבט מים sonicating במשך 30 דקות. הסירו את מכסה היתד והחליפו במכסה שטוח סטנדרטי של צלחת מיקרוטיטר שטוחה שאינה צמודה כדי למנוע זיהום. דגירה בתנאי מאמץ אופטימליים במהלך הלילה.

למחרת, להעביר 200 microliters מן צלחת באר עמוקה לצלחת microtiter סטנדרטית ולקרוא את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר. כתמים סגול קריסטל היא שיטה יעילה בשימוש נרחב של קירוב הביומסה של ביופילמים חיידקיים. כתמים סגולים קריסטליים של התקני הבאר הסטנדרטית והעמוקה הראו כי שני מיני החיידקים גדלו באופן משמעותי יותר ביומסה על מכשיר הבאר העמוקה בהשוואה למכשיר הסטנדרטי עם Escherichia coli היוצר פי 2.1 יותר ביומסה בהשוואה למכשיר הביופילם הסטנדרטי ו- Pseudomonas aeruginosa ויוצר פי 4.1 יותר ביומסה.

תוצאות אלה היו עקביות עם ההשערה שלנו כי שטח הפנים המוגבר של מכשיר biofilm באר עמוקה יאפשר הצטברות ביומסה מוגברת. למרות שונות רבה יותר בערכים טכניים מוכתמים CV עבור שני הזנים הגדלים על התקן הבאר העמוקה, לא צוינו הבדלים מובהקים סטטיסטית עבור המשכפלים הביולוגיים של אף אחד מהמינים באמצעות ANOVA דו-כיוונית או מבחן T של התלמיד עם ערכי P גדולים מ- 0.05. ממצא זה מראה כי היווצרות biofilm על ידי מכשירי באר עמוקה טופס biofilms לשחזור דומה לזה של מכשירים סטנדרטיים.

התוצאות שלנו לאחר סטנדרטיזציה ביופלזמה ביופילם עבור נפח ויתד שטח הפנים בין מכשירי באר סטנדרטית ועמוקה הצביעו על העדפה חומרית קלה אך משמעותית בין שני מיני החיידקים שנבדקו. במכשיר הבאר העמוקה פוליפרופילן, פסאודומונס אירוגינוזה הדגים עלייה יחסית של פי 1.4 בהיווצרות ביומסה ו- Escherichia coli הדגים ירידה יחסית של פי 1.52 בהיווצרות ביומסה עם ההשפעה ההפוכה שנצפתה במכשיר הסטנדרטי פוליסטירן. הבדל זה בהעדפת מינים חיידקיים לחומר יתד התקן ביופילם מצביע על כך שלא ניתן להשוות את התוצאות בין מכשירי ביופילם.

אתגר מיקרוביאלי של ביופילמים 24 שעות ביממה נבדק באמצעות תרכובת אמוניום quaternary בנזלקוניום כלוריד אשר ידוע כמעכב יעיל של היווצרות ביופילם חיידקי, אבל מיקרוביאלית פחות יעילה להשמדת ביופילם. התוצאות שלנו הראו שערכי BMEC של BZK שהתקבלו ממכשיר הביופילם העמוק גדלו פי שישה בממוצע עבור Escherichia coli ופי שמונה עבור פסאודומונס אירוגינוזה בהשוואה לצמיחה במכשיר הביופילם הסטנדרטי. תוצאות BZK MBEC היו משתנות יותר כצפוי שכן הוא מיקרוביאלית פחות יעילה למיגור ביופילם והובילה לטווח לערכי Escherichia coli MBEC בשני המכשירים בשל כמה יתדות ביופילם חריגות ששרדו בריכוזים גבוהים יותר.

השווינו גם את אקונומיקת החיטוי, הידועה כאנטימיקרוביאלית יעילה מאוד למיגור ביופילם חיידקי. אקונומיקה הדגימה ערך MBEC מעט גבוה יותר כאשר נבדקה במכשיר הסטנדרטי בהשוואה למכשיר הבאר העמוקה עבור שני המינים, מה שהוביל לעלייה של פי ארבעה בקולי Escherichia ולעלייה כפולה ב- Pseudomonas aeruginosa בהתאמה. עם זאת, הבדלים אלה היו בטווח של שגיאה לשחזור בין מכשירים והפגינו הרבה פחות שונות מאשר BZK, המאשר אקונומיקה כאנטימיקרוביאלית יעילה יותר למיגור ביופילם.

מגבלה מרכזית של כל מכשיר ביופילם תהיה הרכב הפלסטיק השונה של היתדות והשונות הנובעת מכך בהיווצרות דבקות וביומסה של מינים חיידקיים שונים למשטחים אלה. בנוסף, יש לקחת בחשבון אינטראקציות כימיות ותאימות בין מיקרוביאלים שונים לחומר היתד הפלסטי לפני ביצוע הפרוטוקול המתואר. לסיכום, פרוטוקול זה והממצאים מהשוואות הביומסה שלנו על הבאר העמוקה והתקני הביופילם הסטנדרטיים מראים כי שניהם מסוגלים לטפח ביופילמים חזקים של Escherichia coli ו- Pseudomonas aeruginosa עם התקן הבאר העמוקה המספק באופן משמעותי יותר ביומסה לכל שטח פנים יתד מאשר המכשיר הסטנדרטי.

מכשיר הביופילם העמוק מציע חלופה בת קיימא ובמחיר סביר לגידול ביופילם סטטי בעל תפוקה גבוהה ומחקרי סינון הדורשים כמויות גדולות יותר של ביופילם לניתוח במורד הזרם. בשל ההבדלים בהרכבי החומרים הפלסטיים בין כל מכשיר, לא ניתן להשוות ישירות את ביופלזמה ביופילם מוכתמת CV וערכי MBEC בין התקנים. עם זאת, אם ניסויים נערכים באופן עקבי על אותו מכשיר, התוצאות המתקבלות בין מבודדים ו antimicrobials דומים.

מכשיר הביופילם בבאר העמוקה מומלץ למעבדות המעוניינות לחקור ביופילמים בבדיקות תפוקה גבוהה באמצעות חומרים בעלות נמוכה.