この手順の目標は、クリスタルバイオレット染色および抗菌感受性試験を通じて、標準的なペグ蓋バイオフィルムデバイスをポリプロピレンディープウェルバイオフィルムデバイスと比較することです。標準的なペグ蓋バイオフィルムデバイスは、96個のペグを有し、標準的な96ウェルマイクロタイタープレートの上に収まり、ハイスループットバイオフィルム実験を可能にする。ペグ蓋はバイオフィルム成長のための表面を提供し、ペグ上で成長したバイオフィルムは下流の実験でさらに分析することができる。
しかし、プレートは最大200マイクロリットルの体積を使用するため、より多くのバイオフィルムを必要とする実験を使用してバイオフィルム形成とバイオマスを研究することはより困難である。ここで、静的バイオフィルムを成長させるためのディープウェルバイオフィルム装置について説明する。ディープウェルバイオフィルム装置は、ペグ蓋としてセミスカート付き96ウェルPCRプレートを備えた96ウェルディープウェルマイクロタイタープレートを利用する。
この方法は、750マイクロリットルの最大プレート体積を可能にし、バイオフィルム成長のためのより多くのペグ表面積を提供し、標準的なバイオフィルム装置と比較してコストが低い。バイオフィルムバイオマスを決定するためのバイオフィルムのクリスタルバイオレット染色のプロトコル、ならびにMBECとしても知られる最小バイオフィルム根絶濃度の決定について説明および比較する。図示は、次に説明する実験の概略概要である。
所望の細菌株を凍結保存ストックから栄養寒天プレート上に直接ストリークする。寒天プレートを最適な株条件で一晩インキュベートする。翌日、単一のコロニーを5ミリリットルの成長培地に接種し、一晩インキュベーター内で培養物を増殖させる。
バイオフィルムプレートは図のように充填されます。外側のウェルを750マイクロリットルの滅菌水で満たし、陰性対照ウェルを750マイクロリットルの滅菌増殖培地で満たします。残りのウェルを675マイクロリットルの滅菌増殖培地で満たします。
一晩培養を600ナノメートルの光学密度1.0に標準化する。10 からマイナス 3 の希釈に達するまで、10 倍の希釈系列を作成します。培地ウェルに10〜マイナス3の希釈培養液を接種し、10〜マイナス4の最終細菌希釈液と最終的な合計インウェル容積750マイクロリットルとする。
ペグの蓋をバイオフィルムプレートに慎重に挿入します。プレートを最適な株条件で、最大振とう160 RPMで24時間インキュベートします。バイオフィルム成長プレートからペグ蓋を慎重に取り外し、ウェルあたり800マイクロリットルの滅菌PBSで満たされた新しいディープウェルプレートでバイオフィルムをすすいでください。
ペグ蓋を、1ウェルあたり800マイクロリットルの0.1体積%重量のクリスタルバイオレットを含む新しいディープウェルプレートに移し、5分間染色する。PBSで満たされた新鮮な深いウェルプレートで蓋をもう一度すすぎ、余分な汚れを取り除きます。バイオセーフティキャビネットで蓋を10分間乾燥させた後、ウェルあたり800マイクロリットルの30%禁欲酸で満たされた深いウェルプレートでペグを5分間染色します。
ペグの蓋を外し、汚れを均等に分散させるために十分に混ぜる。ディープウェルバイオフィルムデバイスから200マイクロリットルを標準的な96ウェルマイクロタイタープレートに移し、550ナノメートルで光学密度を読み取る。抗菌チャレンジプレートは、図示のように調製される。
外側のウェルを750マイクロリットルの滅菌水で満たし、陽性および陰性対照ウェルを750マイクロリットルの成長培地で満たします。残りのウェルを750マイクロリットルの所望の抗菌希釈シリーズで満たす。ペグの蓋を装置から慎重に取り外し、PBSのウェルあたり800マイクロリットルの滅菌ディープウェルプレートですすいでください。
ペグ蓋を抗菌チャレンジプレートに移し、所望の暴露時間枠でインキュベートする。抗菌暴露プレートからペグ蓋を無菌的に取り外し、滅菌ディープウェルPBS充填プレートですすいでください。PBSからペグ蓋を取り外し、ウェルあたり750マイクロリットルの回収培地を含む新しいディープウェルプレートに移します。
超音波処理水浴中でプレートを30分間超音波処理する。ペグ蓋を取り外し、汚染を避けるために、標準の非固定フラットトップマイクロタイタープレート蓋と交換します。最適な株条件で一晩インキュベートする。
翌日、200マイクロリットルをディープウェルプレートから標準マイクロタイタープレートに移し、600ナノメートルで光学密度を読み取った。クリスタルバイオレット染色は、細菌バイオフィルムのバイオマスを近似する効果的で広く使用されている方法です。標準ウェルデバイスおよびディープウェルデバイスのクリスタルバイオレット染色は、両方の細菌種が、標準バイオフィルムデバイスおよびシュードモナス緑膿菌が4.1倍のバイオマスを形成する標準デバイスと比較して、標準デバイスと比較して、ディープウェルデバイス上で有意に多くのバイオマスを増殖させることを示した。
これらの結果は、ディープウェルバイオフィルム装置の表面積の増加がバイオマス蓄積の増加を可能にするという我々の仮説と一致した。ディープウェル装置で増殖する両株のCV染色値の技術的反復のばらつきが大きいにもかかわらず、ペアワイズ二元配置分散分析またはP値が0.05より大きい学生のT検定を使用して、どちらの種の生物学的反復についても統計的に有意な差は認められなかった。この知見は、ディープウェルデバイスによるバイオフィルム形成が、標準的なデバイスと同様の再現性のあるバイオフィルムを形成することを示している。
バイオフィルムバイオマスを標準井戸装置と深井戸装置の間の体積およびペグ表面積について標準化した後の我々の結果は、試験した2つの細菌種間の僅かではあるが有意な材料選好を示した。ポリプロピレン製ディープウェル装置では、緑膿菌はバイオマス形成の1.4倍の相対的増加を示し、大腸菌はバイオマス形成の1.52倍の相対的減少を示し、ポリスチレン標準装置で観察された逆効果を示した。バイオフィルムデバイスペグ材料に対する細菌種の選好におけるこの差は、バイオフィルムデバイス間で結果をクロス比較することができないことを示している。
24時間バイオフィルムの抗菌性チャレンジは、細菌バイオフィルム形成の有効な阻害剤であることが知られている第四級アンモニウム化合物塩化ベンザルコニウムを用いて試験されたが、バイオフィルム根絶にはあまり効果的ではない抗菌性である。我々の結果は、ディープウェルバイオフィルムデバイスから得られたBZK BMEC値が、標準的なバイオフィルムデバイス上の成長と比較して、大腸菌で平均6倍、緑膿菌で8倍に増加したことを示した。BZK MBECの結果は、バイオフィルム根絶にあまり効果的ではない抗菌薬であり、高濃度で生存したいくつかの外れ値バイオフィルムペグのために、両方のデバイスで大腸菌MBEC値の範囲をもたらしたため、予想通りより可変的であった。
また、細菌バイオフィルム根絶に非常に有効な抗菌剤であることが知られている消毒剤漂白剤を比較した。漂白剤は、両方の種のディープウェル装置と比較して標準装置で試験した場合、わずかに高いMBEC値を示し、それぞれ大腸菌の4倍の増加および緑膿菌の2倍の増加をもたらした。しかし、これらの違いは、デバイス間の再現可能な誤差の範囲内にあり、BZKよりもはるかに少ない変動性を示し、漂白剤がバイオフィルム根絶のためのより効果的な抗菌薬であることが確認された。
各バイオフィルム装置の主な制限は、ペグの異なる塑性組成と、これらの表面への異なる細菌種の付着およびバイオマス形成における結果としての変動性であろう。さらに、異なる抗菌剤とプラスチックペグ材料との間の化学的相互作用および適合性は、記載されたプロトコルを実行する前に考慮されなければならない。結論として、このプロトコルと、ディープウェルと標準バイオフィルムデバイスに関するバイオマス比較からの知見は、どちらも堅牢な大腸菌および緑膿菌バイオフィルムを培養することができ、ディープウェルデバイスは、標準デバイスよりもペグ表面積あたり有意に多くのバイオマスを提供することを示しています。
ディープウェルバイオフィルムデバイスは、下流分析のために大量のバイオフィルムを必要とする静的でハイスループットのバイオフィルム培養およびスクリーニング研究のための実行可能で手頃な価格の代替手段を提供します。各デバイス間のプラスチック材料組成の違いにより、CV染色されたバイオフィルムバイオマスおよびMBEC値は、デバイス間で直接比較することはできない。しかし、実験が同じ装置で一貫して行われる場合、分離株と抗菌剤の間で得られる結果は同等である。
ディープウェルバイオフィルムデバイスは、低コストの材料を使用したハイスループットアッセイでバイオフィルムを研究したいラボに推奨されます。
