Denne protokol beskriver teknikken til at generere musemodeller, der bærer primær osteosarkom og lungemetastaselæsionerne. Ved intratibial injektion af osteosarkomceller efterligner denne model bedst de kliniske udviklingsegenskaber ved tumorosteosarkom. Nøjagtige antal osteosarkomceller injiceres direkte i skinnebenet ved hjælp af en mikrovolumensprøjte, hvilket muliggør identiske tumordannelseshastigheder og tumorvolumener.
På dagen for osteosarkomcelleinjektion vaskes cellerne to gange med PBS. Trypsiniser cellerne med 1,5 ml 0,25% trypsin i tre minutter. Tilsæt derefter seks milliliter 10% serumholdige MEM-medier.
Saml cellerne i et 15 milliliter centrifugerør. Aspiratér 20 mikroliter cellesuspension ind i celletællepladens kammer, og beregn cellekoncentrationen ved hjælp af en automatisk celletæller. Centrifugering af cellerne ved 800 gange g i fem minutter ved stuetemperatur.
Aspirer supernatanten med en pipette, resuspend cellepillen i en 8,5 milligram pr. Milliliter kældermembranmatrix og læg dem på is. Placer musen i liggende stilling. Hold musens ankel ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren, og desinficer injektionsstedet for skinnebenet med en 70% ethanolpind.
Drej ankelleddet på hver mus udad for at bevæge skinnebenet og fibulaen, og bøj knæleddet til en passende position, indtil det proksimale skinnebensplateau er synligt gennem huden. Fastgør nålen til en sprøjte på en milliliter, og ret nålespidsen mod injektionsstedet, parallelt med skinnebenets akse. Indsæt perkutant nålen for at bore et hul gennem skinnebensplatformen mod den distale ende af skinnebenet.
Læg osteosarkomcellesuspensionen, der tidligere er anbragt på is, i en mikrovolumsprøjte, og udskift sprøjten på en milliliter i skinnebenet med den osteosarkomcellebelastede mikrovolumsprøjte. Indsprøjt langsomt ca. 10 mikroliter osteosarkomcellesuspension i hver athymisk muss skinneben uden at lægge meget pres på. Fjern derefter mikrovolumsprøjten fra injektionsstedet, og tryk på stedet med vatpinden i ca. 30 sekunder.
Placer musen tilbage i et rent bur, og observer dens genopretning i 10 minutter. Denne figur viser musemodellen med ortotopisk osteosarkom udviklet fra intratibiel osteosarkomcelleinjektion og dens isolerede form. En gradvis stigning i tumorvolumenet observeres hver uge.
Røntgenbillederne opnået fra den første til den sjette uge efter injektion af luciferase-mærkede osteosarkomceller viste en gradvis stigning i volumen. Desuden viste billedet opnået efter injektionen i museskinnebenet ortotopisk osteosarkomvækst in vivo. Lungemetastasen forårsaget af intratibial injektion af osteosarkomcellerne blev med succes sporet in vivo ved hjælp af et bioluminescens levende billeddannelsessystem.
Observation under et stereomikroskop afslørede metastatiske kolonier i det isolerede lungevæv. HE farvning på paraffinindlejret lungevæv viste metastatiske læsioner. Nålen skal perkutant indsættes i ledkapslen gennem patellarbåndet for at bore et hul gennem skinnebensplatformen mod det digitale skinneben ved at dreje sprøjten.