Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل دويتشه فرانشونجسجيمينشافت (BA 3679/5-1؛ 1؛ 1. ل 2289: BA 3679/4-2). يتم دعم A.K. من خلال زمالة ERASMUS+ . نشكر إيريس بونسلي-إهريت وريتا روزنر وأندريا شليكسوب على إعداد الخلايا العصبية الأولية. نشكر الدكتور توبياس ديك على توفير pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. أجريت التجارب المبينة في الشكل 4 في مركز نيكون للتصوير، جامعة هايدلبرغ. وقد أعد الشكل 2 BioRender.com.

وتتوافق جميع التجارب على الحيوانات مع المبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية، بما في ذلك توجيه المجلس 2010/63/EU للبرلمان الأوروبي، وكانت لها موافقة أخلاقية كاملة من وزارة الداخلية (مكتب رعاية الحيوان بجامعة هايدلبرغ وريجيرونغسبرايسيديوم كارلسروه، رخصا T14/21 و T13/21). تم إعداد الخلايا العصبية الأ...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

توفر القياسات الكمية والديناميكية لحالة أكسدة الميتوكوندريا معلومات مهمة حول الميتوكوندريا وعلم وظائف الأعضاء الخلوي. تتوفر العديد من المسابير الكيميائية الفلورية التي تكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية أو "إجهاد الأكسدة" أو "الإجهاد التأكسدي". غير أن المصطلحات الأخيرة ليست محددة تحديدا ...

العديد من الإنزيمات الميتوكوندريا الهامة وجزيئات الإشارات تخضع لتنظيم أكسدة الثيول1. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا هي مصدر خلوي رئيسي لأنواع الأكسجين التفاعلية وعرضة بشكل انتقائي للتلف التأكسدي2. وبناء على ذلك، فإن إمكانات أكسدة الميتوكوندريا تؤثر بشكل مباشر على الجيوجيات الحيوية، وإشارات الخلايا، ووظيفة الميتوكوندريا، وفي نهاية المطاف صلاحية الخلية3،4. مصفوفة الميتوكوندريا يحتوي على كميات عالية (1-15 mM) من الغلوتاثيون العازلة أكسدة الثيول-ديسوليد (GSH) للحفاظ على التوازن الأكسدة وجبل الدفاعات المضادة للأكسدة5,6. يمكن ربط GSH بشكل مشترك بالبروتينات المستهدفة (S-glutathionylation) للتحكم في حالة الأكسدة ونشاطها ويستخدم من قبل مجموعة من الإنزيمات مزيلة للسموم التي تقلل من البروتينات المؤأكسدة. ولذلك، فإن إمكانات أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا هي معلمة غنية بالمعلومات للغاية عند دراسة وظيفة الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية.
roGFP2 هو البديل من GFP التي جعلت من حساسية الأكسدة بإضافة اثنين من السيستينات السطحية المكشوفة التي تشكل ثنائي ثنائي هذاول-ديبريتيد الاصطناعية 7,8. لديها ذروة انبعاث واحد في ~ 510 نانومتر وقممتين الإثارة في ~ 400 نانومتر و 490 نانومتر. الأهم من ذلك ، فإن السعة النسبية للقممتين الإثارة تعتمد على حالة الأكسدة من roGFP2 (الشكل 1) ، مما يجعل هذا البروتين جهاز استشعار نسبة. في مستشعر Grx1-roGFP2، تم دمج الجلوتاريدوشين-1 البشري (Grx1) في N-terminus من roGFP29,10. المرفق التكافؤي لانزيم Grx1 إلى roGFP2 يتيح اثنين من التحسينات الرئيسية للاستشعار: فهو يجعل استجابة الاستشعار محددة لزوج GSH / GSSG الجلوتاثيون أكسدة (الشكل 1)، وأنه يسرع التوازن بين GSSG وroGFP2 بعامل لا يقل عن 100،0009. لذلك ، يتيح Grx1-roGFP2 تصويرا محددا وديناميكيا لإمكانات أكسدة الجلوتاثيون الخلوية.
يمكن إجراء التصوير Grx1-roGFP2 على مجموعة واسعة من المجاهر، بما في ذلك المجاهر الفلورية واسعة النطاق، والمجاهر confocal القرص الغزل، والمجاهر confocal المسح بالليزر. يمكن تحقيق التعبير عن المستشعر في الخلايا العصبية الأولية بطرق مختلفة تشمل شفط الدهون11 ، الحمض النووي / الكالسيوم فوسفات coprecipitation12 ، نقل الجينات بوساطة الفيروس ، أو استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا كمصدر للخلية (الشكل 2). الزائفة المؤتلفة الفيروسات المرتبطة أدينو (rAAV) التي تحتوي على نسبة 1:1 من AAV1 وAAV2 capsid البروتينات 13,14 استخدمت للتجارب في هذه المقالة. مع هذا المتجه ، عادة ما يتم الوصول إلى أقصى تعبير استشعار بعد 4-5 أيام من العدوى ويبقى مستقرا لمدة أسبوعين على الأقل. لقد استخدمنا بنجاح Grx1-roGFP2 في الخلايا العصبية فرس النهر والقشرية الأولية من الفئران والجرذان.
في هذه المقالة، يتم استخدام التعبير بوساطة rAAV من الميتوكوندريا المستهدفة Grx1-roGFP2 في فرس النهر الفئران الأولية والخلايا العصبية القشرية لتقييم حالة أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا القاعدية واضطراباتها الحادة. يتم توفير بروتوكول للتصوير الحي confocal مع تعليمات مفصلة حول كيفية (1) تحسين إعدادات المجهر confocal المسح بالليزر ، (2) تشغيل تجربة التصوير الحي ، و (3) تحليل البيانات مع فيجي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

الميتوكوندريا الأكسدة التوازن مهم البقاء العصبية وظيفة. على الرغم من أن الميتوكوندريا تحتوي على العديد من أنظمة الأكسدة، يعتبر الجلوتاثيون العازلة للثيول-ديسول-ديسولفيد الوفيرة جدا لاعبا مركزيا في الدفاعات المضادة للأكسدة. ولذلك، قياس إمكانات أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا يوفر معلومات مفيدة حول حالة الأكسدة الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) هو مؤشر نسبي مشفر وراثيا والأخضر الفلوري (GFP) لإمكانات أكسدة الجلوتاثيون التي لديها قمتين للإثارة حساسة للأكسدة عند 400 نانومتر و490 نانومتر مع ذروة انبعاث واحدة عند 510 نانومتر. توضح هذه المقالة كيفية إجراء المجهر الحي confocal من الميتوكوندريا المستهدفة Grx1-roGFP2 في الخلايا العصبية فرس النهر والقشرية الأولية. وهو يصف كيفية تقييم حالة ثابتة الميتوكوندريا الجلوتاثيون أكسدة المحتملة (على سبيل المثال، لمقارنة حالات المرض أو العلاجات على المدى الطويل) وكيفية قياس التغيرات الأكسدة على العلاجات الحادة (باستخدام المخدرات excitotoxic N-ميثيل-D-الأسبارتات (NMDA) كمثال). بالإضافة إلى ذلك ، يعرض المقال التصوير المشترك ل Grx1-roGFP2 ومؤشر إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، tetramethylrhodamine ، استر الإيثيل (TMRE) ، لإظهار كيف يمكن مضاعفة Grx1-roGPF2 مع مؤشرات إضافية للتحليلات متعددة البارامترية. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية (1) تحسين إعدادات مجهر المسح بالليزر البؤري ، (2) تطبيق الأدوية للتحفيز تليها معايرة الاستشعار مع دياميد وديثيوثيريتول ، و (3) تحليل البيانات مع ImageJ / FIJI.

القياس الكمي للاختلافات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا الثابتة بعد انسحاب عامل النمو لإثبات كمية الاختلافات في الحالة الثابتة في حالة الأكسدة الميتوكوندريا ، تمت مقارنة الخلايا العصبية الأولية التي تزرع في الوسط القياسي بالخلايا العصبية المستزرعة دون عوامل نمو لمدة 48 ساعة قب...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

توضح هذه المقالة بروتوكول لتحديد الاختلافات في حالة الأكسدة القاعدية واستجابات الأكسدة الحمراء للاضطرابات الحادة في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر والقشرية باستخدام المجهر الحي confocal. يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى والمجاهر مع الحد الأدنى من التعديلات.

التصوير الحي لحالة الميتوكوندريا الجلوتاثيون ريدوكسي في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر قياس النسب

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

تسمح هذه الطريقة بالتحقيق في كيفية تأثر حالة أكسدة الميتوكوندريا في الحالات المرضية الفسيولوجية. ويمكن استخدامه أيضا لتقييم فعالية استراتيجيات العلاج التي تهدف إلى حماية الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لجهاز وتقييم محدد للتغيرات الديناميكية والتتبع على حالة أكسدة الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي.يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع مؤشرات إضافية لتسجيل في وقت واحد، على سبيل المثال، غشاء الميتوكوندريا المحتملة أو تركيزات الكالسيوم بالإضافة إلى حالة الأكسدة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خلايا الاستزراع، ونباتات الأنسجة، وشرائح الثقافات. ابدأ بتحسين إعدادات المجهر البؤري المسح الضوئي.للقيام بذلك، قم بتعيين الكاشف إلى 12 بت أو 16 بت، وقم بتنشيط وضع المسح التسلسلي وإضافة تسلسل/مسار ثان. لكلا القناتين، حدد جدول بحث زائف للألوان يشير إلى البيكسلات فوق البكسلات التي تم تعريضها بشكل ناقص ثم حدد هدفا مناسبا للهدف محل الاهتمام. جبل غطاء مع الخلايا في غرفة التصوير.أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتصوير وضع الغرفة على المجهر. استخدام العدسة والضوء المنقول لتركيز الخلايا. تسجيل الصور بتنسيقات بكسل مختلفة وأحجام الثقب.ثم تسجيل الصور مع كثافة الليزر المختلفة، وبالتالي ضبط كسب كاشف والعتبة. وأخيرا، سجل الصور بسرعات مسح مختلفة وأعداد مختلفة من متوسطات الإطارات. للتصوير الحي، قم بتعيين الفاصل الزمني الفاصل الزمني إلى 30 ثانية والمدة إلى 25 دقيقة.ثم تركيب الخلايا، ووضع الغرفة على المجهر وتركيز الخلايا كما هو موضح سابقا. قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي واستخدم قناة 488 نانومتر في المنظر المباشر للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير. اختياريا، لزيادة عدد الخلايا المسجلة لكل تشغيل، استخدم الدالة متعددة النقاط لصورة حقلين إلى ثلاثة حقول للعرض لكل غطاء.ابدأ عملية الحصول على الفاصل الزمني وسجل خمس صور كتسجيل أساسي لمدة دقيقتين. إضافة 500 ميكرولتر من حل NMDA 3X إلى الغرفة لتحقيق التركيز النهائي من 30 ميكرومولار وتسجيل 20 صورة إضافية كاستجابة NMDA لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من حل 4X DA إلى الغرفة وسجل ست صور أخرى.يستنشق المخزن المؤقت من غرفة التصوير ويستبدله بمليلتر واحد من محلول DTT. بعد تسجيل 10 صور أخرى، قم بإنهاء التسجيل وحفظ سلسلة الصور. لاستيراد البيانات في برنامج تحليل الصور ، انقر على الإضافات ، حدد الأشكال الحيوية ، ثم تنسيقات الحيوي المستورد.في مربع الحوار، اختر hyperstack في مكدس العرض مع، ثم قم بتعيين وضع اللون كإعداد افتراضي وحدد المقياس التلقائي. تغيير تنسيق الصورة إلى 32 بت عن طريق النقر على الصورة، وتحديد نوع، ومن ثم من الخيارات، اختر 32 بت. لتقسيم قنوات الألوان إلى نوافذ منفصلة، انقر على الصورة، انتقل إلى اللون، وحدد تقسيم القنوات.ضبط عتبة لتحديد الميتوكوندريا للتحليل عن طريق النقر على الصورة، واختيار ضبط والعتبة. في مربع الحوار، حدد الخلفية الداكنة الحمراء الافتراضية وتكدس الرسم البياني. عندما تظهر البيكسلات المحددة باللون الأحمر، انقر فوق تطبيق.ثم حدد تعيين وحدات بكسل الخلفية إلى NAN معالجة كافة الصور وتنفيذ نفس الإجراء للقناة الثانية. لتصور نسبة 405 إلى 488 نانومتر، إنشاء صورة نسبة عن طريق النقر على عملية وآلة حاسبة الصورة. في مربع الحوار، حدد القناة الأولى في صورة واحدة قسمة في قناة العملية الثانية في الصورة الثانية.ثم حدد إنشاء نافذة جديدة ومعالجة جميع الصور. تغيير جدول البحث عن صورة النسبة إلى اللون الزائف بالنقر فوق الصورة، وتحديد جداول البحث، ثم إطلاق النار. لتحليل الصورة، رسم ROIs حول الخلايا الفردية أو الميتوكوندريا على صورة النسبة.لإضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار، انتقل إلى التحليل، انقر على الأدوات، حدد مدير عائد الاستثمار، انقر على إضافة وحدد إظهار كل شيء. لقياس نسب 405 إلى 488 نانومتر من الخلايا الفردية، انقر على مدير عائد الاستثمار، حدد جميع ROIs عن طريق الضغط على Control A، انتقل إلى أكثر وحدد multi-measure. في مربع الحوار، حدد قياس كافة الشرائح والصف الواحد لكل شريحة.بعد تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات، حدد صورة 405 نانومتر، وقياس كثافة جميع ROIs، ومرة أخرى تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات. وبالمثل، قم بقياس كثافة عائد الاستثمار لصورة 488 نانومتر. لحفظ ROIs للرجوع إليها في المستقبل، حدد كافة ROIs بالضغط على Control A، ثم انتقل إلى المزيد وحدد حفظ.هذه اللقطات التمثيلية من تسجيل الفاصل الزمني تظهر صور نسبة الخلايا العصبية قبل وبعد العلاج NMDA وبعد معايرة ماكس / دقيقة مع DA و DTT. علاج الخلايا العصبية مع 30 nmDA ميكرومولار المستحثة أكسدة الميتوكوندريا في غضون بضع دقائق. وكشف تحليل القنوات الفلورية الفردية أن حمض الميتوكوندريا الناجم عن NMDA تسبب في انخفاض مضان GFP على كل من 405 و 488 نانومتر من الإثارة.في تجربة التحكم ، حال العلاج المسبق مع DA دون أي أكسدة الميتوكوندريا الأخرى من قبل NMDA. وبناء على ذلك، فإن نسبة 405 إلى 488 لم تتغير على الرغم من إخماد كبير لكثافة الفلورية GFP2 الحساسة للأكسدة. وأكدت هذه التجربة أن نسبة 405 إلى 488 نانومتر لا تتأثر بالتغيرات في الحموضة.في تجربة منفصلة ، تم تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وحالة الأكسدة ، ومورفولوجيا بالتوازي. علاج الخلايا العصبية مع 60 NMDA ميكرومولار أدى إلى فقدان رباعي ميثيلرهودامين أو إشارة TMRE وزيادة في 405 إلى 488 نانومتر rho GFP نسبة تليها بعض التقريب تأخر الميتوكوندريا. عند البدء في استخدام هذه الطريقة، من المهم جدا أن تأخذ بعض الوقت لتحسين الإعدادات المجهرية بعناية.وهذا سوف يساعد على الحفاظ على صحة الخلايا العصبية أثناء التجارب الخاصة بك. من المهم جدا أيضا احترام قواعد السلامة بالليزر دائما. تأكد من عدم التعرض لإشعاع الليزر عند إضافة أدوية للعبث بها أثناء التسجيلات المباشرة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

قياس التوصيل في البصرية المسار الابتدائي في المهق الإنسان عن طريق التصوير إنتشار العضلة الشادة وTractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...