Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes af et ERASMUS+-stipendium. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for forberedelsen af primære neuroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for at levere pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 blev udført på Nikon Imaging Center, Universitetet i Heidelberg. Figur 2 blev udarbejdet med BioRender.com.

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med nationale og institutionelle retningslinjer, herunder Rådets direktiv 2010/63/EU i Europa-Parlamentet, og havde fuld etisk godkendelse fra indenrigsministeriet (Universitetet i Heidelberg' dyrevelfærdskontor og Regierungspraesidium Karlsruhe, licenserne T14/21 og T13/21). Primære hippocampale og kortikale neuroner blev fremstillet af nyfødte mus- eller rotteunger i henhold til standardprocedurer og blev opretholdt i 12-14 dage som tidligere beskrevet13</su...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Kvantitative og dynamiske målinger af mitokondrie redox tilstand giver vigtige oplysninger om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kemiske sonder er tilgængelige, der registrerer reaktive iltarter, "redox stress" eller "oxidativ stress." Sidstnævnte udtryk er imidlertid ikke veldefinerede og mangler ofte specificitet9,17,18. Sammenlignet med kemiske farvestoffer tilbyder Grx1-roGFP2 flere for...

Flere vigtige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt thiol redox regulering1. Desuden er mitokondrier en vigtig cellulær kilde til reaktive iltarter og er selektivt sårbare over for oxidative skader2. Derfor mitokondrie redox potentiale direkte påvirker bioenergetik, celle signalering, mitokondrie funktion, og i sidste ende celle levedygtighed3,4. Mitokondrie matrix indeholder store mængder (1-15 mM) af thiol-disulfid redox buffer glutathion (GSH) for at opretholde redox homøostase og montere antioxidant forsvar5,6. GSH kan være kovalent knyttet til målproteiner (S-glutathionylation) for at kontrollere deres redox-status og aktivitet og bruges af en række afgiftende enzymer, der reducerer oxiderede proteiner. Derfor er mitokondrie glutathion redox potentiale en meget informativ parameter, når man studerer mitokondrie funktion og patofysiologi.
roGFP2 er en variant af GFP, der er blevet gjort redox-følsomme ved tilsætning af to overflade-eksponerede cysteiner, der danner en kunstig dithiol-disulfid par7,8. Det har en enkelt emission peak på ~ 510 nm og to excitation toppe på ~ 400 nm og 490 nm. Det er vigtigt, at de relative amplituder af de to excitationstoppe afhænger af roGFP2's redox-tilstand (figur 1), hvilket gør dette protein til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2 sensoren er human glutaredoxin-1 (Grx1) blevet smeltet til N-endestationen for roGFP29,10. Kovalent fastgørelse af Grx1-enzymet til roGFP2 giver to store forbedringer af sensoren: Det gør sensorresponset specifikt for GSH/GSSG glutathion redox-parret (figur 1), og det fremskynder ækvilibreringen mellem GSSG og roGFP2 med en faktor på mindst 100.0009. Derfor muliggør Grx1-roGFP2 specifik og dynamisk billeddannelse af det cellulære glutathion redox-potentiale.
Grx1-roGFP2 billeddannelse kan udføres på en bred vifte af mikroskoper, herunder widefield fluorescens mikroskoper, spinning disk konfokale mikroskoper, og laser scanning konfokale mikroskoper. Ekspression af sensoren i primære neuroner kan opnås ved forskellige metoder, der omfatter lipofection11, DNA / calcium-fosfat coprecipitation12, virusmedieret genoverførsel eller brug af transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotyped rekombinant adeno-associerede vira (rAAV), der indeholder en 1:1 forholdet mellem AAV1 og AAV2 capsid proteiner 13,14 blev brugt til eksperimenter i denne artikel. Med denne vektor, maksimal sensor udtryk er typisk nået 4-5 dage efter infektion og forbliver stabil i mindst to uger. Vi har med succes brugt Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale neuroner fra mus og rotter.
I denne artikel, rAAV-medieret udtryk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale neuroner bruges til at vurdere basal mitokondrie glutathion redox tilstand og dens akutte forstyrrelser. En protokol er fastsat for confocal live imaging med detaljerede instruktioner om, hvordan (i) optimere laser scanning konfokale mikroskop indstillinger, (ii) køre en levende billedbehandling eksperiment, og (iii) analysere data med FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Mitokondrie redox homøostase er vigtigt for neuronal levedygtighed og funktion. Selvom mitokondrier indeholder flere redox-systemer, betragtes den meget rigelige thiol-disulfid redox buffer glutathion som en central aktør i antioxidantforsvar. Derfor, måling af mitokondrie glutathion redox potentiale giver nyttige oplysninger om mitokondrie redox status og oxidativ stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-baseret ratiometrisk indikator for glutathion redox-potentialet, der har to redox-state-følsomme excitation toppe ved 400 nm og 490 nm med en enkelt emissionstop ved 510 nm. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører konfokal levende mikroskopi af mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale neuroner. Den beskriver, hvordan man vurderer steady-state mitokondrie glutathion redox potentiale (f.eks at sammenligne sygdomstilstande eller langsigtede behandlinger) og hvordan man måler redox ændringer på akutte behandlinger (ved hjælp af excitotoksiske stof N-methyl-D-aspartat (NMDA) som et eksempel). Derudover præsenterer artiklen co-imaging af Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotentialeindikatoren, tetramethylrhodamin, ethyl ester (TMRE), for at demonstrere, hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplexes med yderligere indikatorer til multiparametriske analyser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan (i) optimerer confocal laser scanning mikroskop indstillinger, (ii) anvende lægemidler til stimulation efterfulgt af sensor kalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.

Kvantificering af forskelle i steady-state mitokondrie redox tilstand efter vækstfaktor tilbagetrækning For at demonstrere kvantificeringen af steady-state forskelle i mitokondrie redox tilstand, primære neuroner dyrket i standard medium blev sammenlignet med neuroner dyrket uden vækstfaktorer for 48 timer før billeddannelse. Vækstfaktor tilbagetrækning resulterer i apoptotisk neuronal celle død efter 72 h16. Celler blev afbildet efter 48 timer for at teste, om dette er...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Denne artikel beskriver en protokol til at bestemme forskelle i basal redox tilstand og redox svar på akutte forstyrrelser i primære hippocampal og kortikale neuroner ved hjælp af konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan anvendes på andre celletyper og mikroskoper med minimale ændringer.

Live Imaging af Mitokondrie Glutathione Redox tilstand i primære neuroner ved hjælp af en ratiometrisk indikator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Denne metode gør det muligt at undersøge, hvordan mitokondrie redox tilstand påvirkes i patofysiologiske forhold. Det kan også bruges til at vurdere effekten af behandlingsstrategier, der har til formål at beskytte mitokondrier. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for et organ og specifik vurdering af dynamiske og sporingsændringer på mitokondrier redox tilstand i realtid.Denne metode kan kombineres med yderligere indikatorer til samtidig at registrere, for eksempel mitokondriemembran potentiale eller calcium koncentrationer ud over redox tilstand. Denne protokol kan anvendes på kulturceller, vævseksplanter og skivekulturer. Begynd med at optimere indstillingerne for scanning af konfokale mikroskoper.Det gør du ved at indstille detektoren til 12 bit eller 16 bit, aktivere den sekventielle scanningstilstand og tilføje endnu en sekvens/spor. For begge kanaler skal du vælge en pseudofarveopslagstabel, der angiver over- og undereksponerede pixel, og vælg derefter et mål, der passer til interesseobjektet. Monter en coverlip med celler ind i billedkammeret.Tilsæt en milliliter billedbuffer, og placer kammeret på mikroskopet. Brug okularet og transmitteret lys til at fokusere cellerne. Optag billeder med forskellige pixelformater og pinhole størrelser.Optag derefter billeder med forskellige laserintensiteter, og juster derfor detektorforøgelsen og -tærsklen. Endelig optage billeder med forskellige scanningshastigheder og forskellige antal ramme gennemsnit. For live imaging, indstille timelapse interval til 30 sekunder og varighed til 25 minutter.Monter derefter cellerne, placer kammeret på mikroskopet og fokuser cellerne som tidligere demonstreret. Skift til scanningstilstand, og brug 488 nanometerkanalen i livevisningen til at fokusere og finde cellerne til billeddannelse. Hvis du vil øge antallet af registrerede celler pr. kørsel, kan du også bruge multipunktsfunktionen til at afbilde to til tre synsfelter pr. forside.Start timelapse erhvervelse og optage fem billeder som en to-minutters baseline optagelse. Tilføj 500 mikroliter af 3X NMDA-opløsning til kammeret for at opnå den endelige koncentration af 30 mikromolar og optage yderligere 20 billeder som en 10-minutters NMDA-respons. Derefter skal du tilføje 500 mikroliter 4X DA-opløsning til kammeret og optage yderligere seks billeder.Aspirer bufferen fra billedkammeret og udskift den med en milliliter DTT-opløsning. Når du har optaget yderligere 10 billeder, skal du afslutte optagelsen og gemme billedserien. For at importere data i billedanalyse software, skal du klikke på plugins, vælg bio formater, og derefter bio formater importør.Vælg hyperstack i visningsstakken med i dialogboksen , angiv farvetilstand som standard, og vælg automatisk skalering. Skift billedformatet til 32 bit ved at klikke på billedet, vælge type og derefter vælge 32 bit fra indstillingerne. Hvis du vil opdele farvekanalerne i separate vinduer, skal du klikke på billedet, gå til farve og vælge opdelte kanaler.Juster tærsklen for at vælge mitokondrier til analyse ved at klikke på billedet, vælge justere og tærskel. Vælg standard rød mørk baggrund i dialogboksen, og stak histogram. Når de markerede pixel vises rødt, skal du klikke på Anvend.Vælg derefter sæt baggrundspixel til NAN behandle alle billeder og udføre den samme procedure for kanal to. Hvis du vil visualisere forholdet mellem 405 og 488 nanometer, skal du oprette et ratiobillede ved at klikke på proces- og billedberegner. Vælg kanal et i billedet et divide i operationskanal to i billede to i billede to i dialogboksen.Vælg derefter opret nyt vindue, og behandl alle billeder. Rediger opslagstabellen for forholdets billede til pseudofarve ved at klikke på billedet, vælge opslagstabeller og derefter skyde. Til analyse af billedet skal du tegne ROI'er omkring individuelle celler eller mitokondrier på forholdets billede.Hvis du vil føje investeringsafkast til ROI Manager, skal du gå til analyse, klikke på værktøjerne, vælge ROI Manager, klikke på Tilføj og vælg vis alle. Hvis du vil måle forholdet mellem 405 og 488 nanometer for de enkelte celler, skal du klikke på ROI Manager, vælge alle investeringsafkast ved at trykke på Kontrol A, gå til flere og vælge multimåle. Vælg mål alle udsnit og én række pr. udsnit i dialogboksen .Når du har eksporteret målingerne til regnearkssoftwaren, skal du vælge 405 nanometerbilledet, måle intensiteten af alle investeringsafkast og igen eksportere målingerne til regnearkssoftwaren. På samme måde måles ROI-intensiteterne i 488 nanometerbilledet. Hvis du vil gemme investeringsafkast til fremtidig reference, skal du vælge alle investeringsafkast ved at trykke på Kontrol A, gå til flere og vælge Gem.Disse repræsentative snapshots fra en timelapse optagelse viser forholdet billeder af neuroner før og efter NMDA behandling og efter max / min kalibrering med DA og DTT. Behandling af neuroner med 30 mikromolar NMDA induceret mitokondrier oxidation inden for få minutter. Analyse af individuelle fluorescenskanaler viste, at NMDA-induceret mitokondriesyreose forårsagede et fald i GFP fluorescens på både 405 og 488 nanometer excitation.I et kontrolforsøg udelukkede forbehandling med DA yderligere mitokondrier oxidation af NMDA. Og derfor ændrede forholdet mellem 405 og 488 sig ikke på trods af en betydelig slukning af rødoxfølsom GFP2 fluorescensintensitet. Dette eksperiment bekræftede, at forholdet mellem 405 og 488 nanometer ikke påvirkes af pH-ændringer.I et separat eksperiment blev mitokondriemembranpotentiale, redox-tilstand og morfologi vurderet parallelt. Behandling af neuronerne med 60 mikromolar NMDA resulterede i tab af tetramethylrhodamin eller TMRE signal og en stigning i 405 til 488 nanometer rho GFP forholdet efterfulgt af nogle forsinkede afrunding af mitokondrier. Når du begynder at bruge denne metode, er det meget vigtigt at tage tid til omhyggeligt at optimere mikroskopiske indstillinger.Dette vil hjælpe med at holde neuronerne sunde under dine eksperimenter. Det er også meget vigtigt altid at overholde lasersikkerhedsregler. Sørg for ikke at blive udsat for laserstråling, når du tilføjer stoffer til manipulation under live optagelser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Udarbejdelse af Primary neuroner til visualisering neurites i frossen hydreret tilstand vha. Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritiske udløbere af Rat Primær hippocampusneuroner hjælp Structured Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Måling Forbindelse i Primary Visual Pathway i Human albinisme Brug Diffusion Tensor Imaging og traktografi

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live Imaging af primære hjernebarken celler ved hjælp af en 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levende billeder af GLUT4 Protein handel med musen primære hypothalamus neuroner ved hjælp af Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...