Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; VOOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wordt ondersteund door een ERASMUS+ beurs. We bedanken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner en Andrea Schlicksupp voor de voorbereiding van primaire neuronen. Wij danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. De experimenten in figuur 4 werden uitgevoerd in het Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg. Figuur 2 is opgesteld met BioRender.com.

Alle dierproeven voldeden aan nationale en institutionele richtlijnen, waaronder richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement van de Raad, en hadden volledige ethische goedkeuring van het ministerie van Binnenlandse Zaken (Bureau voor Dierenwelzijn van de Universiteit van Heidelberg en Regierungspraesidium Karlsruhe, vergunningen T14/21 en T13/21). Primaire hippocampus- en corticale neuronen werden bereid uit pasgeboren muizen- of rattenjongen volgens standaardprocedures en werden gedurende 12-14 dagen gehandhaafd zoa...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Kwantitatieve en dynamische metingen van de mitochondriale redoxtoestand leveren belangrijke informatie op over mitochondriale en cellulaire fysiologie. Er zijn verschillende fluorogene chemische sondes beschikbaar die reactieve zuurstofsoorten, "redoxstress" of "oxidatieve stress" detecteren. Deze laatste termen zijn echter niet goed gedefinieerd en missen vaak specificiteit9,17,18. In vergelijking met chemische kleurstoffen bi...

Verschillende belangrijke mitochondriale enzymen en signaalmoleculen zijn onderhevig aan thiol redox regulatie1. Bovendien zijn mitochondriën een belangrijke cellulaire bron van reactieve zuurstofsoorten en zijn ze selectief kwetsbaar voor oxidatieve schade2. Dienovereenkomstig heeft het mitochondriale redoxpotentiaal direct invloed op bio-energetica, celsignalering, mitochondriale functie en uiteindelijk de levensvatbaarheid van cellen3,4. De mitochondriale matrix bevat grote hoeveelheden (1-15 mM) van de thiol-disulfide redoxbuffer glutathion (GSH) om de redoxhomeostase te behouden en de antioxidantafweer te versterken5,6. GSH kan covalent worden gehecht aan doeleiwitten (S-glutathionylatie) om hun redoxstatus en -activiteit te beheersen en wordt gebruikt door een reeks ontgiftende enzymen die geoxideerde eiwitten verminderen. Daarom is de mitochondriale glutathion redoxpotentiaal een zeer informatieve parameter bij het bestuderen van mitochondriale functie en pathofysiologie.
roGFP2 is een variant van GFP die redoxgevoelig is gemaakt door de toevoeging van twee aan het oppervlak blootgestelde cysteines die een kunstmatig dithiol-disulfidepaar vormen7,8. Het heeft een enkele emissiepiek bij ~ 510 nm en twee excitatiepieken bij ~ 400 nm en 490 nm. Belangrijk is dat de relatieve amplitudes van de twee excitatiepieken afhankelijk zijn van de redoxtoestand van roGFP2 (figuur 1), waardoor dit eiwit een ratiometrische sensor is. In de Grx1-roGFP2-sensor is humaan glutaredoxine-1 (Grx1) gefuseerd met het N-eindpunt van roGFP29,10. Covalente hechting van het Grx1-enzym aan roGFP2 biedt twee belangrijke verbeteringen van de sensor: het maakt de sensorrespons specifiek voor het GSH / GSSG glutathion redoxpaar (figuur 1) en het versnelt de evenwichtsbalans tussen GSSG en roGFP2 met een factor van ten minste 100.0009. Daarom maakt Grx1-roGFP2 specifieke en dynamische beeldvorming van het cellulaire glutathion redoxpotentiaal mogelijk.
Grx1-roGFP2-beeldvorming kan worden uitgevoerd op een breed scala aan microscopen, waaronder widefield fluorescentiemicroscopen, confocale microscopen voor draaiende schijven en confocale microscopen voor laserscanning. Expressie van de sensor in primaire neuronen kan worden bereikt door verschillende methoden, waaronder lipofectie11, DNA / calciumfosfaatcoprecipitatie12, virusgemedieerde genoverdracht of gebruik van transgene dieren als celbron (figuur 2). Pseudotypeerde recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) met een 1:1 verhouding van AAV1 en AAV2 capsid eiwitten 13,14 werden gebruikt voor de experimenten in dit artikel. Met deze vector wordt de maximale sensorexpressie meestal 4-5 dagen na infectie bereikt en blijft deze gedurende ten minste twee weken stabiel. We hebben Grx1-roGFP2 met succes gebruikt in primaire hippocampus- en corticale neuronen van muizen en ratten.
In dit artikel wordt rAAV-gemedieerde expressie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen van ratten gebruikt om de basale mitochondriale glutathion redoxtoestand en de acute verstoring ervan te beoordelen. Er is een protocol voor confocale live beeldvorming met gedetailleerde instructies voor het optimaliseren van (i) het optimaliseren van confocale microscoopinstellingen voor laserscannen, (ii) het uitvoeren van een live beeldvormingsexperiment en (iii) het analyseren van gegevens met FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Mitochondriale redox homeostase is belangrijk voor neuronale levensvatbaarheid en functie. Hoewel mitochondriën verschillende redoxsystemen bevatten, wordt de zeer overvloedige thiol-disulfide redoxbuffer glutathion beschouwd als een centrale speler in de antioxidantafweer. Daarom levert het meten van het mitochondriale glutathion redoxpotentiaal nuttige informatie op over mitochondriale redoxstatus en oxidatieve stress. Glutaredoxine1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is een genetisch gecodeerde, op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde ratiometrische indicator van de glutathion redoxpotentiaal die twee redoxtoestandsgevoelige excitatiepieken heeft bij 400 nm en 490 nm met een enkele emissiepiek bij 510 nm. Dit artikel beschrijft hoe confocale levende microscopie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen kan worden uitgevoerd. Het beschrijft hoe steady-state mitochondriaal glutathion redoxpotentieel kan worden beoordeeld (bijvoorbeeld om ziektetoestanden of langetermijnbehandelingen te vergelijken) en hoe redoxveranderingen bij acute behandelingen kunnen worden gemeten (met behulp van het excitotoxische medicijn N-methyl-D-aspartaat (NMDA) als voorbeeld). Daarnaast presenteert het artikel co-imaging van Grx1-roGFP2 en de mitochondriale membraanpotentiaalindicator, tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), om aan te tonen hoe Grx1-roGPF2 kan worden gemultiplext met aanvullende indicatoren voor multiparametrische analyses. Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van hoe (i) confocale laserscanmicroscoopinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd, (ii) geneesmiddelen voor stimulatie kunnen worden toegepast gevolgd door sensorkalibratie met diamide en dithiothreitol, en (iii) gegevens kunnen worden geanalyseerd met ImageJ / FIJI.

Kwantificering van verschillen in steady-state mitochondriale redoxtoestand na terugtrekking van de groeifactor Om de kwantificering van steady-state verschillen in mitochondriale redoxtoestand aan te tonen, werden primaire neuronen gekweekt in standaardmedium vergeleken met neuronen gekweekt zonder groeifactoren gedurende 48 uur vóór beeldvorming. Onttrekking van groeifactoren resulteert in apoptotische neuronale celdood na 72 h16. Cellen werden na 48 uur in beeld gebracht o...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Deze methode maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe mitochondriale redoxtoestand wordt beïnvloed in pathofysiologische omstandigheden. Het kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van behandelingsstrategieën te beoordelen die gericht zijn op het beschermen van mitochondriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een orgaan en specifieke beoordeling van dynamische en tracerende veranderingen in mitochondriale redoxtoestand in realtime mogelijk maakt.Deze methode kan worden gecombineerd met extra indicatoren om tegelijkertijd bijvoorbeeld mitochondriaal membraanpotentiaal of calciumconcentraties te registreren naast de redoxtoestand. Dit protocol kan worden toegepast op kweekcellen, weefselexplantaten en snijculturen. Begin met het optimaliseren van de scan confocale microscoopinstellingen.Om dit te doen, stelt u de detector in op 12 bits of 16 bits, activeert u de sequentiële scanmodus en voegt u een tweede reeks / track toe. Selecteer voor beide kanalen een pseudo-kleurenopzoektabel die over- en onderbelichte pixels aangeeft en selecteer vervolgens een doelstelling die geschikt is voor het object van interesse. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer.Voeg een milliliter beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen. Neem afbeeldingen op met verschillende pixelindelingen en pinhole-formaten.Neem vervolgens beelden op met verschillende laserintensiteiten en pas dienovereenkomstig de detectorversterking en -drempel aan. Neem ten slotte afbeeldingen op met verschillende scansnelheden en verschillende aantallen framegemiddelden. Voor live beeldvorming stelt u het timelapse-interval in op 30 seconden en de duur op 25 minuten.Monteer vervolgens de cellen, plaats de kamer op de microscoop en focus de cellen zoals eerder aangetoond. Schakel over naar de scanmodus en gebruik het kanaal van 488 nanometer in de liveweergave om de cellen scherp te stellen en te lokaliseren voor beeldvorming. Als u het aantal opgenomen cellen per run wilt verhogen, gebruikt u desgewenst de multipuntsfunctie om twee tot drie gezichtsvelden per coverslip weer te geven.Start de timelapse-acquisitie en neem vijf afbeeldingen op als een basislijnopname van twee minuten. Voeg 500 microliter 3X NMDA-oplossing toe aan de kamer om de uiteindelijke concentratie van 30 micromolair te bereiken en neem nog eens 20 beelden op als een NMDA-respons van 10 minuten. Voeg vervolgens 500 microliter 4X DA-oplossing toe aan de kamer en neem nog zes beelden op.Zuig de buffer uit de beeldvormingskamer op en vervang deze door één milliliter DTT-oplossing. Na het opnemen van nog 10 beelden, beëindigt u de opname en slaat u de beeldreeks op. Voor het importeren van de gegevens in de beeldanalysesoftware klikt u op plug-ins, selecteert u bioformaten en vervolgens bio-indelingen importeren.Kies in het dialoogvenster hyperstack in de weergavestack met, stel de kleurmodus in als standaard en selecteer automatisch schalen. Wijzig de afbeeldingsindeling in 32 bits door op afbeelding te klikken, type te selecteren en vervolgens uit de opties 32-bits te kiezen. Als u de kleurkanalen in afzonderlijke vensters wilt splitsen, klikt u op afbeelding, gaat u naar kleur en selecteert u gesplitste kanalen.Pas de drempel aan om de mitochondriën voor analyse te selecteren door op de afbeelding te klikken en pas aan en drempel. Selecteer in het dialoogvenster standaard rode donkere achtergrond en stapel histogram. Wanneer de geselecteerde pixels rood lijken, klikt u op toepassen.Selecteer vervolgens achtergrondpixels instellen om alle afbeeldingen te verwerken en dezelfde procedure uit te voeren voor kanaal twee. Voor het visualiseren van de nanometerverhouding van 405 tot 488 maakt u een verhoudingsafbeelding door op proces- en beeldcalculator te klikken. Selecteer in het dialoogvenster kanaal één in afbeelding één verdeel in bewerkingskanaal twee in afbeelding twee.Selecteer vervolgens Nieuw venster maken en verwerk alle afbeeldingen. Wijzig de opzoektabel van de verhoudingsafbeelding in pseudokleur door op de afbeelding te klikken, opzoektabellen te selecteren en vervolgens te openen. Voor het analyseren van het beeld tekent u ROI's rond individuele cellen of mitochondriën op het verhoudingsbeeld.Om de ROI's toe te voegen aan ROI-manager, gaat u naar analyseren, klikt u op de tools, selecteert u ROI-manager, klikt u op toevoegen en selecteert u alles weergeven. Om de 405 tot 488 nanometerverhoudingen van individuele cellen te meten, klikt u op ROI-manager, selecteert u alle ROI's door op Control A te drukken, gaat u naar meer en selecteert u multi-measure. Selecteer in het dialoogvenster alle segmenten meten en één rij per segment.Nadat u de metingen naar de spreadsheetsoftware hebt geëxporteerd, selecteert u de afbeelding van 405 nanometer, meet u de intensiteiten van alle ROI's en exporteert u de metingen opnieuw naar de spreadsheetsoftware. Meet op dezelfde manier de ROI-intensiteiten van het beeld van 488 nanometer. Als u de ROI's wilt opslaan voor toekomstig gebruik, selecteert u alle ROIs door op Control A te drukken, naar meer te gaan en opslaan te selecteren.Deze representatieve snapshots van een timelapse-opname tonen ratiobeelden van neuronen voor en na NMDA-behandeling en na max/min kalibratie met DA en DTT. Behandeling van de neuronen met 30 micromolaire NMDA geïnduceerde mitochondriale oxidatie binnen enkele minuten. Analyse van individuele fluorescentiekanalen onthulde dat NMDA-geïnduceerde mitochondriale acidose een daling van GFP-fluorescentie veroorzaakte bij zowel 405 als 488 nanometer excitatie.In een controle-experiment sloot voorbehandeling met DA verdere mitochondriale oxidatie door NMDA uit. En dienovereenkomstig veranderde de verhouding 405 tot 488 niet, ondanks een aanzienlijke doving van redoxgevoelige GFP2-fluorescentie-intensiteit. Dit experiment bevestigde dat de verhouding van 405 tot 488 nanometer niet wordt beïnvloed door pH-veranderingen.In een afzonderlijk experiment werden mitochondriaal membraanpotentiaal, redoxtoestand en morfologie parallel beoordeeld. Behandeling van de neuronen met 60 micromolaire NMDA resulteerde in het verlies van tetramethylrhodamine of TMRE-signaal en een toename van de 405 tot 488 nanometer rho GFP-verhouding gevolgd door enkele vertraagde afronding van mitochondriën. Wanneer u deze methode begint te gebruiken, is het erg belangrijk om de tijd te nemen om microscopische instellingen zorgvuldig te optimaliseren.Dit zal helpen om de neuronen gezond te houden tijdens uw experimenten. Het is ook erg belangrijk om altijd de laserveiligheidsregels te respecteren. Zorg ervoor dat u niet wordt blootgesteld aan laserstraling wanneer u medicijnen toevoegt om te knoeien tijdens live-opnames.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Het meten van connectiviteit in de primaire visuele Pathway in Human Albinisme Met behulp van Diffusion Tensor Imaging en tractografie

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live beelden van GLUT4 eiwit mensenhandel muis primaire hypothalame neuronen met behulp van deconvolutie microscopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...