Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FÜR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wird durch ein ERASMUS+ Stipendium unterstützt. Wir danken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner und Andrea Schlicksupp für die Präparation primärer Neuronen. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Die in Abbildung 4 gezeigten Experimente wurden am Nikon Imaging Center der Universität Heidelberg durchgeführt. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.

Alle Tierversuche entsprachen den nationalen und institutionellen Richtlinien, einschließlich der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments des Rates, und verfügten über eine vollständige ethische Genehmigung des Innenministeriums (Tierwohlamt der Universität Heidelberg und Regierungspraesidium Karlsruhe, Lizenzen T14/21 und T13/21). Primäre Hippocampus- und kortikale Neuronen wurden aus neugeborenen Maus- oder Rattenwelpen nach Standardverfahren hergestellt und wie zuvor beschrieben für 12-14 Tage <sup c...

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Quantitative und dynamische Messungen des mitochondrialen Redoxzustandes liefern wichtige Informationen über die mitochondriale und zelluläre Physiologie. Es stehen mehrere fluorogene chemische Sonden zur Verfügung, die reaktive Sauerstoffspezies, "Redoxstress" oder "oxidativen Stress" erkennen. Die letztgenannten Begriffe sind jedoch nicht klar definiert und haben oft keine Spezifität9,17,18. Im Vergleich zu chemischen Farb...

Mehrere wichtige mitochondriale Enzyme und Signalmoleküle unterliegen der Thiol-Redox-Regulation1. Darüber hinaus sind Mitochondrien eine wichtige zelluläre Quelle reaktiver Sauerstoffspezies und selektiv anfällig für oxidative Schäden2. Dementsprechend wirkt sich das mitochondriale Redoxpotential direkt auf die Bioenergetik, die Zellsignalisierung, die mitochondriale Funktion und letztendlich auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus3,4. Die mitochondriale Matrix enthält hohe Mengen (1-15 mM) des Thiol-Disulfid-Redoxpuffers Glutathion (GSH), um die Redoxhomöostase aufrechtzuerhalten und die antioxidative Abwehr aufzubauen5,6. GSH kann kovalent an Zielproteine gebunden werden (S-Glutathionylierung), um ihren Redoxstatus und ihre Aktivität zu kontrollieren, und wird von einer Reihe von entgiftenden Enzymen verwendet, die oxidierte Proteine reduzieren. Daher ist das mitochondriale Glutathion-Redoxpotential ein sehr informativer Parameter bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktion und Pathophysiologie.
roGFP2 ist eine Variante von GFP, die durch Zugabe von zwei oberflächenexponierten Cysteinen, die ein künstliches Dithiol-Disulfid-Paar bilden, redoxempfindlich gemacht wurde7,8. Es hat einen einzelnen Emissionspeak bei ~510 nm und zwei Anregungsspitzen bei ~400 nm und 490 nm. Wichtig ist, dass die relativen Amplituden der beiden Anregungsspitzen vom Redoxzustand von roGFP2 abhängen (Abbildung 1), was dieses Protein zu einem ratiometrischen Sensor macht. Im Grx1-roGFP2-Sensor wurde humanes Glutaredoxin-1 (Grx1) mit dem N-Terminus von roGFP29,10 verschmolzen. Die kovalente Bindung des Grx1-Enzyms an roGFP2 ermöglicht zwei wesentliche Verbesserungen des Sensors: Es macht die Sensorantwort spezifisch für das GSH/GSSG-Glutathion-Redox-Paar (Abbildung 1) und beschleunigt das Gleichgewicht zwischen GSSG und roGFP2 um einen Faktor von mindestens 100.0009. Daher ermöglicht Grx1-roGFP2 eine spezifische und dynamische Abbildung des zellulären Glutathion-Redoxpotentials.
Grx1-roGFP2-Bildgebung kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, einschließlich Weitfeldfluoreszenzmikroskopen, rotierenden konfokalen Scheibenmikroskopen und konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Expression des Sensors in primären Neuronen kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, darunter Lipofektion11, DNA/Calcium-Phosphat-Kopräzipitation12, virusvermittelter Gentransfer oder die Verwendung transgener Tiere als Zellquelle (Abbildung 2). Pseudotypisierte rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV), die ein 1:1-Verhältnis von AAV1- und AAV2-Kapsidproteinen 13,14 enthielten, wurden für die Experimente in diesem Artikel verwendet. Mit diesem Vektor wird die maximale Sensorexpression typischerweise 4-5 Tage nach der Infektion erreicht und bleibt mindestens zwei Wochen lang stabil. Wir haben Grx1-roGFP2 erfolgreich in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen von Mäusen und Ratten eingesetzt.
In diesem Artikel wird die rAAV-vermittelte Expression von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Ratte verwendet, um den basalen mitochondrialen Glutathion-Redoxzustand und seine akute Störung zu beurteilen. Für die konfokale Live-Bildgebung wird ein Protokoll mit detaillierten Anweisungen bereitgestellt, wie (i) die Einstellungen für konfokale Laserscanning-Mikroskope optimiert, (ii) ein Live-Imaging-Experiment durchgeführt und (iii) Daten mit FIJI analysiert werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Die mitochondriale Redoxhomöostase ist wichtig für die neuronale Lebensfähigkeit und Funktion. Obwohl Mitochondrien mehrere Redoxsysteme enthalten, gilt der sehr häufige Thiol-Disulfid-Redoxpuffer Glutathion als zentraler Akteur in der antioxidativen Abwehr. Daher liefert die Messung des mitochondrialen Glutathion-Redoxpotentials nützliche Informationen über den mitochondrialen Redoxstatus und oxidativen Stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) ist ein genetisch kodierter, auf grün fluoreszierendem Protein (GFP) basierender ratiometrischer Indikator des Glutathion-Redoxpotentials, der zwei Redox-Zustands-sensitive Anregungspeaks bei 400 nm und 490 nm mit einem einzigen Emissionspeak bei 510 nm aufweist. Dieser Artikel beschreibt, wie man konfokale Live-Mikroskopie von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen durchführt. Es beschreibt, wie das mitochondriale Glutathion-Redoxpotenzial im Steady-State-Stadium beurteilt werden kann (z. B. zum Vergleich von Krankheitszuständen oder Langzeitbehandlungen) und wie Redoxveränderungen bei akuten Behandlungen gemessen werden können (am Beispiel des exzitoxischen Arzneimittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA). Darüber hinaus stellt der Artikel die Co-Imaging von Grx1-roGFP2 und dem mitochondrialen Membranpotentialindikator Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) vor, um zu demonstrieren, wie Grx1-roGPF2 mit zusätzlichen Indikatoren für multiparametrische Analysen gemultiplext werden kann. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie (i) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopeinstellungen optimiert, (ii) Medikamente zur Stimulation mit anschließender Sensorkalibrierung mit Diamid und Dithiothreitol angewendet und (iii) Daten mit ImageJ/FIJI analysiert werden.

Quantifizierung von Unterschieden im stationären mitochondrialen Redoxzustand nach Wachstumsfaktorentzug Um die Quantifizierung von Steady-State-Unterschieden im mitochondrialen Redoxzustand zu demonstrieren, wurden primäre Neuronen, die in einem Standardmedium gezüchtet wurden, mit Neuronen verglichen, die 48 Stunden vor der Bildgebung ohne Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Der Entzug des Wachstumsfaktors führt nach 72 h16 zum apoptotischen neuronalen Zelltod. Die Zelle...

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Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Diese Methode ermöglicht es zu untersuchen, wie der mitochondriale Redoxzustand unter pathophysiologischen Bedingungen beeinflusst wird. Es kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu bewerten, die auf den Schutz der Mitochondrien abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Organ und eine spezifische Beurteilung dynamischer und nachverfolgender Veränderungen des Redoxzustands der Mitochondrien in Echtzeit ermöglicht.Diese Methode kann mit zusätzlichen Indikatoren kombiniert werden, um neben dem Redoxzustand auch mitochondriales Membranpotential oder Calciumkonzentrationen gleichzeitig zu erfassen. Dieses Protokoll kann auf Kulturzellen, Gewebeexplantaten und Schnittkulturen angewendet werden. Beginnen Sie mit der Optimierung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops.Stellen Sie dazu den Detektor auf 12 Bit oder 16 Bit ein, aktivieren Sie den sequenziellen Scanmodus und fügen Sie eine zweite Sequenz/Spur hinzu. Wählen Sie für beide Kanäle eine Pseudofarb-Nachschlagetabelle aus, die über- und unterbelichtete Pixel anzeigt, und wählen Sie dann ein Objektiv aus, das für das Objekt von Interesse geeignet ist. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer.Fügen Sie einen Milliliter Bildpuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren. Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Pixelformaten und Lochgrößen auf.Nehmen Sie dann Bilder mit unterschiedlichen Laserintensitäten auf und passen Sie die Detektorverstärkung und den Schwellenwert entsprechend an. Nehmen Sie schließlich Bilder mit unterschiedlichen Scangeschwindigkeiten und unterschiedlichen Bilddurchschnitten auf. Stellen Sie für die Live-Bildgebung das Zeitrafferintervall auf 30 Sekunden und die Dauer auf 25 Minuten ein.Montieren Sie dann die Zellen, legen Sie die Kammer auf das Mikroskop und fokussieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal in der Live-Ansicht, um die Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren. Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Durchlauf zu erhöhen, verwenden Sie optional die Multi-Point-Funktion, um zwei bis drei Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.Starten Sie die Zeitraffererfassung und nehmen Sie fünf Bilder als zweiminütige Baseline-Aufnahme auf. Fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 3X NMDA-Lösung hinzu, um die Endkonzentration von 30 Mikromol zu erreichen, und zeichnen Sie zusätzliche 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Reaktion auf. Als nächstes fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 4X DA-Lösung hinzu und nehmen sechs weitere Bilder auf.Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer ab und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter DVB-T-Lösung. Nachdem Sie 10 weitere Bilder aufgenommen haben, beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie. Um die Daten in die Bildanalysesoftware zu importieren, klicken Sie auf Plugins, wählen Sie Bio-Formate und dann Bio-Format-Importer.Wählen Sie im Dialogfeld Hyperstack im Ansichtsstapel mit aus, legen Sie den Farbmodus als Standard fest und wählen Sie automatische Skalierung. Ändern Sie das Bildformat in 32 Bit, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und dann aus den Optionen 32 Bit auswählen. Um die Farbkanäle in separate Fenster aufzuteilen, klicken Sie auf Bild, gehen Sie zu Farbe und wählen Sie geteilte Kanäle.Passen Sie den Schwellenwert an, um die Mitochondrien für die Analyse auszuwählen, indem Sie auf das Bild klicken und Anpassen und Schwellenwert auswählen. Wählen Sie im Dialogfeld den standardmäßigen roten dunklen Hintergrund und das Stapelhistogramm aus. Wenn die ausgewählten Pixel rot erscheinen, klicken Sie auf Übernehmen.Wählen Sie dann Set background pixels to NAN verarbeiten alle Bilder und führen Sie den gleichen Vorgang für Kanal zwei aus. Um das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern zu visualisieren, erstellen Sie ein Verhältnisbild, indem Sie auf Prozess und Bildrechner klicken. Wählen Sie im Dialogfeld Kanal eins in Bild eins teilen in Vorgang Kanal zwei in Bild zwei.Wählen Sie dann Neues Fenster erstellen und alle Bilder verarbeiten. Ändern Sie die Nachschlagetabelle des Verhältnisbilds in Pseudofarbe, indem Sie auf Bild klicken, Nachschlagetabellen auswählen und dann auslösen. Um das Bild zu analysieren, zeichnen Sie ROIs um einzelne Zellen oder Mitochondrien auf dem Verhältnisbild.Um die ROIs zum ROI-Manager hinzuzufügen, gehen Sie zu Analysieren, klicken Sie auf die Tools, wählen Sie ROI-Manager, klicken Sie auf Hinzufügen und wählen Sie Alle anzeigen. Um die 405- bis 488-Nanometer-Verhältnisse einzelner Zellen zu messen, klicken Sie auf ROI-Manager, wählen Sie alle ROIs durch Drücken von Control A aus, gehen Sie zu more und wählen Sie multi-measure. Wählen Sie im Dialogfeld Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen aus.Nachdem Sie die Messungen in die Tabellenkalkulationssoftware exportiert haben, wählen Sie das 405-Nanometer-Bild aus, messen Sie die Intensität aller ROIs und exportieren Sie die Messungen erneut in die Tabellenkalkulationssoftware. Messen Sie in ähnlicher Weise die ROI-Intensitäten des 488-Nanometer-Bildes. Um die ROIs für zukünftige Referenzzwecke zu speichern, wählen Sie alle ROIs aus, indem Sie Steuerung A drücken, gehen Sie zu mehr und wählen Sie Speichern.Diese repräsentativen Schnappschüsse aus einer Zeitrafferaufzeichnung zeigen Verhältnisbilder von Neuronen vor und nach der NMDA-Behandlung und nach der Max/Min-Kalibrierung mit DA und DTT. Die Behandlung der Neuronen mit 30 mikromolarer NMDA induzierte die Mitochondria-Oxidation innerhalb weniger Minuten. Die Analyse einzelner Fluoreszenzkanäle ergab, dass die NMDA-induzierte mitochondriale Azidose einen Abfall der GFP-Fluoreszenz bei einer Anregung von 405 und 488 Nanometern verursachte.In einem Kontrollexperiment schloss die Vorbehandlung mit DA eine weitere Mitochondria-Oxidation durch NMDA aus. Und dementsprechend änderte sich das Verhältnis 405 zu 488 trotz einer erheblichen Abschreckung der redoxsensitiven GFP2-Fluoreszenzintensität nicht. Dieses Experiment bestätigte, dass das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern nicht durch pH-Änderungen beeinflusst wird.In einem separaten Experiment wurden das mitochondriale Membranpotential, der Redoxzustand und die Morphologie parallel bewertet. Die Behandlung der Neuronen mit 60 mikromolarer NMDA führte zum Verlust des Tetramethylrhodamin- oder TMRE-Signals und zu einer Erhöhung des Rho-GFP-Verhältnisses von 405 bis 488 Nanometern, gefolgt von einer verzögerten Auffrischung der Mitochondrien. Wenn Sie mit der Anwendung dieser Methode beginnen, ist es sehr wichtig, sich Zeit zu nehmen, um die mikroskopischen Einstellungen sorgfältig zu optimieren.Dies wird dazu beitragen, die Neuronen während Ihrer Experimente gesund zu halten. Es ist auch sehr wichtig, die Lasersicherheitsregeln immer zu beachten. Stellen Sie sicher, dass Sie keiner Laserstrahlung ausgesetzt sind, wenn Sie während Live-Aufnahmen Medikamente zur Manipulation hinzufügen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Mess Konnektivität im primären Sehbahn im Bereich Human Albinismus Diffusion Tensor-Bildgebung und Traktographie

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...