Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (BA 3679/5-1; עבור 2289: BA 3679/4-2). A.K. נתמך על ידי מלגת ERASMUS + . אנו מודים לאיריס בנזלי-ארט, ריטה רוזנר ואנדראה שליקסופ על הכנת תאי העצב העיקריים. אנו מודים לד"ר טוביאס דיק על שסיפק pLPCX-מיטו-Grx1-roGFP2. ניסויים שהוצגו באיור 4 בוצעו במרכז הדמיה ניקון, אוניברסיטת היידלברג. איור 2 הוכן עם BioRender.com.

כל הניסויים בבעלי חיים התאימו להנחיות הלאומיות והמוסדיות, כולל הוראת המועצה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי, והיה להם אישור אתי מלא של משרד הפנים (המשרד לרווחת בעלי החיים של אוניברסיטת היידלברג ו- Regierungspraesidium Karlsruhe, רישיונות T14/21 ו- T13/21). נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הוכנ...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

מדידות כמותיות ודינמיות של מצב ההוקסיד המיטוכונדריאלי מספקות מידע חשוב על פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית ופיזיולוגיה תאית. מספר בדיקות כימיות פלואורוגניות זמינות המזהות מינים של חמצן תגובתי, "לחץ אדום", או "עקה חמצונית". עם זאת, המונחים האחרונים אינם מוגדרים היטב ולעתים קרובות חסרים ספציפיות9...

מספר אנזימים מיטוכונדריאליים חשובים ומולקולות איתות כפופים לוויסות תיול redox1. יתר על כן, המיטוכונדריה הם מקור תאי מרכזי של מינים חמצן תגובתי והם פגיעים באופן סלקטיבי לנזק חמצוני2. בהתאם לכך, פוטנציאל ההשמטה המיטוכונדריאלי משפיע ישירות על הביו-אנרגטיקה, איתות התא, תפקוד המיטוכונדריה, ובסופו של דבר על כדאיות התא3,4. המטריצה המיטוכונדריאלית מכילה כמויות גבוהות (1-15 מ"מ) של הגלוטתיון של מאגר התיול-דיסולפיד (GSH) לשמירה על הומיאוסטזיס ולהגנות נוגדות חמצון להרה5,6. GSH יכול להיות מחובר covalenting חלבונים היעד (S-גלוטתיוניליציה) כדי לשלוט במצבם מחדש ופעילותם והוא משמש על ידי מגוון של אנזימים detoxifying להפחית חלבונים מחומצנים. לכן, פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון המיטוכונדריאלי הוא פרמטר אינפורמטיבי מאוד בעת לימוד תפקוד מיטוכונדריאלי ופתופיזיולוגיה.
roGFP2 היא גרסה של GFP שנעשתה רגישה ל-redox על ידי תוספת של שני צייסטנים חשופים פני השטח היוצרים זוג dithiol-disulfide מלאכותי7,8. יש לו שיא פליטה יחיד ב ~ 510 ננומטר ושתי פסגות עירור ב ~ 400 ננומטר ו 490 ננומטר. חשוב לציין, המשרעת היחסית של שתי פסגות העירור תלויות במצב ההוקסר מחדש של roGFP2 (איור 1), מה שהופך את החלבון הזה לחיישן רצימטרי. בחיישן Grx1-roGFP2, גלוטרוקסין-1 אנושי הותך לטרמינל N של roGFP29,10. התקשרות קוולנטית של האנזים Grx1 ל- roGFP2 מעניקה שני שיפורים עיקריים של החיישן: היא הופכת את תגובת החיישן לספציפית עבור זוג הגלוטתיון GSH/GSSG (איור 1), והוא מאיץ את השיוויון בין GSSG ל- roGFP2 בגורם של לפחות 100,0009. לכן, Grx1-roGFP2 מאפשר הדמיה ספציפית ודינמית של פוטנציאל הגלוטתיון התאי מחדש.
הדמיית Grx1-roGFP2 יכולה להתבצע במגוון רחב של מיקרוסקופים, כולל מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבים, מיקרוסקופים קונפוקליים מסתובבים של דיסקים ומיקרוסקופים קונפוקליים לסריקת לייזר. ביטוי החיישן בתאי העצב העיקריים יכול להתבצע בשיטות שונות הכוללות ליפופקטיון11, COPRECIPitation DNA/סידן-פוספט12, העברת גנים בתיווך וירוסים או שימוש בבעלי חיים מהונדסים כמקור התא (איור 2). וירוסים רקומביננטיים מדומים (rAAV) המכילים יחס של 1:1 של חלבונים קבסידיים AAV1 ו- AAV2 13,14 שימשו לניסויים במאמר זה. עם וקטור זה, ביטוי חיישן מקסימלי הוא הגיע בדרך כלל 4-5 ימים לאחר ההדבקה ונשאר יציב לפחות שבועיים. השתמשנו בהצלחה Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח מעכברים וחולדות.
במאמר זה, ביטוי בתיווך rAAV של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפול חולדה ראשוני נוירונים קליפת המוח משמש להערכת מצב גלוטתיון מיטוכונדריאלי בזאלי ואת ההפרעה החריפה שלה. פרוטוקול מסופק עבור הדמיה חיה confocal עם הוראות מפורטות כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ קונפוקליות סריקת לייזר, (ii) להפעיל ניסוי הדמיה חיה, ו -(iii) לנתח נתונים עם FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

הומיאוסטזיס מיטוכונדריאלי redox חשוב עבור הכדאיות העצבית ותפקוד. למרות המיטוכונדריה מכילים מספר מערכות redox, תיול-דיסולפיד חוצץ גלוטתיון נחשב לשחקן מרכזי בהגנות נוגדות חמצון. לכן, מדידת פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי מספק מידע שימושי על מצב תיקון מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני. גלוטרדוקסין1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) הוא אינדיקטור יחסמטרי מבוסס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המקודד גנטית (GFP) של פוטנציאל הגלוטתיון מחדש בעל שתי פסגות עירור רגישות למצב אדום ב-400 ננומטר ו-490 ננומטר עם שיא פליטה יחיד של 510 ננומטר. מאמר זה מתאר כיצד לבצע מיקרוסקופיה חיה קונפוקלית של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח. הוא מתאר כיצד להעריך גלוטתיון מיטוכונדריאלי במצב יציב מחדש את הפוטנציאל (למשל, להשוות מצבי מחלה או טיפולים ארוכי טווח) וכיצד למדוד שינויים redox על טיפולים חריפים (באמצעות התרופה excitotoxic N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) כדוגמה). בנוסף, המאמר מציג הדמיה משותפת של Grx1-roGFP2 ואת אינדיקטור פוטנציאל המילוכונדריה, tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), כדי להדגים כיצד Grx1-roGPF2 יכול להיות multiplexed עם אינדיקטורים נוספים עבור ניתוחים multiparametric. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוצלי, (ii) להחיל תרופות לגירוי ואחריו כיול חיישנים עם דימיד ודית'רייטול, ו- (iii) לנתח נתונים עם ImageJ / FIJI.

כימות הבדלים במצב מיטוכונדריאלי יציב לאחר נסיגת גורם גדילה כדי להדגים את הכימות של הבדלים במצב יציב במצב redox מיטוכונדריאלי, נוירונים ראשוניים גדלו במדיום סטנדרטי הושוו נוירונים בתרבית ללא גורמי גדילה עבור 48 שעות לפני הדמיה. נסיגה גורם גדילה תוצאות מוות תאי עצביים אפופטוטי לאח?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

שיטה זו מאפשרת לחקור כיצד מצב redox מיטוכונדריאלי מושפע בתנאים פתופיציולוגיים. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את היעילות של אסטרטגיות טיפול שמטרתן להגן על המיטוכונדריה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת איבר והערכה ספציפית של שינויים דינמיים ומעקב על מצב מיטוכונדריה redox בזמן אמת.שיטה זו יכולה להיות משולבת עם אינדיקטורים נוספים לרשום בו זמנית, למשל, פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי או ריכוזי סידן בנוסף למצב redox. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאי תרבות, explants רקמה ותרביות פרוסה. התחל על-ידי מיטוב הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי של הסריקה.כדי לעשות זאת, הגדר את הגלאי ל- 12 סיביות או 16 סיביות, הפעל את מצב הסריקה הרציף והוסף רצף/רצועה שניים. עבור שני הערוצים, בחר טבלת בדיקת מידע בצבע מדומה המציינת פיקסלים מעל וחלוף תחתון ולאחר מכן בחר מטרה המתאימה לאובייקט העניין. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה.הוסף מיליליטר אחד של מאגר הדמיה והניח את התא על המיקרוסקופ. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים. הקלט תמונות עם תבניות פיקסלים בגדלים שונים של חורי סיכה.לאחר מכן להקליט תמונות בעוצמות לייזר שונות ובהתאם להתאים את הרווח ואת הסף גלאי. לבסוף, הקלט תמונות עם מהירויות סריקה שונות ומספרים שונים של ממוצעי מסגרות. עבור הדמיה חיה, הגדר את מרווח הזמן ל- 30 שניות ואת משך הזמן ל- 25 דקות.לאחר מכן הרכבה על התאים, מניחים את התא על המיקרוסקופ וממקדים את התאים כפי שהודגם בעבר. עבור למצב סריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה החיה כדי להתמקד ולאתר את התאים להדמיה. לחלופינית, כדי להגדיל את מספר התאים המוקלטים בכל ריצה, השתמש בפונקציה מרובת הנקודות כדי לתמונה שניים עד שלושה שדות תצוגה לכל כיסוי.התחל את רכישת timelapse והקלט חמש תמונות כהקלטה בסיסית של שתי דקות. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון 3X NMDA לתא כדי להשיג את הריכוז הסופי של 30 מיקרומולר ולרשום 20 תמונות נוספות כתגובת NMDA של 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון DA 4X לתא והקלט שש תמונות נוספות.שאף את המאגר מתא ההדמיה והחלף אותו במיליליטר אחד של פתרון DTT. לאחר הקלטת 10 תמונות נוספות, סיים את ההקלטה ושמור את סדרת התמונות. לייבוא הנתונים בתוכנת ניתוח התמונה, לחץ על תוספים, בחר תבניות ביו ולאחר מכן יבואן ביו-פורמטים.בתיבת הדו-שיח , בחר ערכת-על בערימת התצוגה עם, הגדר מצב צבע כברירת מחדל ובחר שינוי קנה מידה אוטומטי. שנה את תבנית התמונה ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת כתב ולאחר מכן מהאפשרויות, בחר 32 סיביות. כדי לפצל את ערוצי הצבע לחלונות נפרדים, לחץ על התמונה, עבור לצבע ובחר ערוצים מפוצלים.התאם את הסף כדי לבחור את המיטוכונדריה לניתוח על ידי לחיצה על התמונה, בחירת התאמה וסף. בתיבת הדו-שיח , בחר רקע כהה אדום המהווה ברירת מחדל וערום היסטוגרמה. כאשר הפיקסלים שנבחרו נראים אדומים, לחץ על החל.לאחר מכן בחרו 'הגדר פיקסלי רקע' ל-NAN מעבדים את כל התמונות ובצעו את אותו הליך עבור ערוץ 2. להדמיה של יחס 405 עד 488 ננומטר, צור תמונת יחס על-ידי לחיצה על מחשבון תהליך ותמונה. בתיבת הדו-שיח , בחר ערוץ אחד בתמונה חלק אחד בערוץ הפעולה 2 בתמונה 2.לאחר מכן בחרו צור חלון חדש ועייץ את כל התמונות. שנה את טבלת בדיקת המידע של תמונת היחס לצבע מדומה על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת טבלאות בדיקת מידע ולאחר מכן אש. לניתוח התמונה, צייר ROIs סביב תאים בודדים או מיטוכונדריה בתמונת היחס.כדי להוסיף את ה- ROIs למנהל ROI, עבור לנתח, לחץ על הכלים, בחר מנהל על ביצוע על ביצועים, לחץ על הוסף ובחר הצג הכל. כדי למדוד את היחסים בין 405 ל-488 ננומטר של תאים בודדים, לחץ על מנהל ההבגיה עלה על ההפרשה, בחר את כל ההעלאות על-ידי הקשה על בקרה A, עבור ליותר ובחר ריבוי מידות. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'מדוד את כל הפרוסות ושורה אחת לכל פרוסה'.לאחר ייצוא המדידות לתוכנת הגיליון האלקטרוני, בחר את תמונת 405 ננומטר, מדוד את עוצמות כל ההחזרים על תנאי ולאחר מכן יצא שוב את המדידות לתוכנת הגיליון האלקטרוני. באופן דומה, למדוד את עוצמות ROI של 488 ננומטר תמונה. לשמירת ההעלות על ההון להריון לעיון עתידי, בחר את כל ההעלות על-ידי הקשה על פקד A, עבור ליותר ובחר שמור.תמונות מייצגות אלה מהקלטת timelapse מציגות תמונות יחס של נוירונים לפני ואחרי טיפול NMDA ולאחר כיול מרבי/דקה עם DA ו- DTT. טיפול של הנוירונים עם 30 מיקרומולר NMDA המושרה חמצון המיטוכונדריה בתוך כמה דקות. ניתוח של ערוצי פלואורסצנטיות בודדים גילה כי חמצת מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי NMDA גרמה לירידה של פלואורסצנטיות GFP הן על 405 והן 488 ננומטר עירור.בניסוי בקרה, טרום טיפול עם DA מנע כל חמצון מיטוכונדריה נוסף על ידי NMDA. ובהתאם, יחס 405 עד 488 לא השתנה למרות מרווה ניכר של עוצמת פלואורסצנטיות GFP2 רגישה ל-Redox. ניסוי זה אישר כי יחס 405 עד 488 ננומטר אינו מושפע משינויי pH.בניסוי נפרד, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, מצב redox ומורפולוגיה הוערכו במקביל. טיפול של הנוירונים עם 60 micromolar NMDA הביא לאובדן של tetramethylrhodamine או אות TMRE ועלייה ביחס 405 עד 488 ננומטר רו GFP ואחריו כמה עיגול מאוחר של המיטוכונדריה. כאשר אתה מתחיל להשתמש בשיטה זו, חשוב מאוד לקחת זמן כדי למטב בקפידה הגדרות מיקרוסקופיות.זה יעזור לשמור על הנוירונים בריאים במהלך הניסויים שלך. חשוב גם לכבד תמיד את כללי הבטיחות בלייזר. הקפד לא להיחשף לקרינת לייזר כאשר אתה מוסיף תרופות כדי לחבל במהלך הקלטות חיות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

מדידת קישוריות במסלול הראייה העיקרית ב לבקנות האדם באמצעות הדמיה דיפוזיה מותח tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...