Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

この作品はドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(BA 3679/5-1;3679/5-1;)2289の場合:BA 3679/4-2)。A.K.はエラスムス+フェローシップによってサポートされています。アイリス・ブンスリ=エーレット、リタ・ロズナー、アンドレア・シュリックサップの原発ニューロンの調製に感謝します。私たちは、pLPCX-ミト-Grx1-roGFP2を提供してくれたトビアス・ディック博士に感謝します。 図4 に示す実験は、ハイデルベルク大学ニコンイメージングセンターで行われました。 図2 は BioRender.com で調製した。

すべての動物実験は、欧州議会の理事会指令2010/63/EUを含む国家および制度的ガイドラインに準拠し、完全な内務省の倫理的承認を得ました(ハイデルベルク大学動物福祉事務所とレジエルングスプラエシジウム・カールスルーエ校、ライセンスT14/21およびT13/21)。一次海馬および皮質ニューロンは、標準的な手順に従って新生児マウスまたはラットの子犬から調製され、前述の13</...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

ミトコンドリアレドックス状態の定量的および動的測定は、ミトコンドリアおよび細胞生理に関する重要な情報を提供する。活性酸素種「酸化ストレス」または「酸化ストレス」を検出するいくつかのフッ素化化学プローブが利用可能です。しかし、後者の用語は明確に定義されておらず、しばしば特異性9,17,18を欠いて?...

いくつかの重要なミトコンドリア酵素およびシグナル伝達分子は、チオール酸化還元調節1の対象となります。さらに、ミトコンドリアは活性酸素種の主要な細胞源であり、酸化的損傷に対して選択的に脆弱である2。したがって、ミトコンドリア酸化還元電位は、バイオエネルギー、細胞シグナル伝達、ミトコンドリア機能、および最終的に細胞生存率3,4に直接影響を及ぼす。ミトコンドリアマトリックスには、酸化還元恒常性を維持し、抗酸化防御剤を搭載するチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオン(GSH)の量(1-15 mM)が多く含まれています。GSHは、標的タンパク質に共有結合(S-グルタチオン化)を使用して酸化還元の状態と活性を制御し、酸化タンパク質を減少させる解毒酵素の範囲で使用されます。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位は、ミトコンドリア機能および病態生理学を研究する際の非常に有益なパラメータである。
roGFP2は、人工ジチオールジスルフィドペア7,8を形成する2つの表面露出システインを添加することによって酸化還元感受性にされたGFPの変異体である。それは〜510 nmで1つの放出ピークを有し、〜400 nmおよび490 nmで2つの励起ピークを有する。重要なことに、2つの励起ピークの相対振幅はroGFP2の酸化還元状態に依存し(図1)、このタンパク質をレシオメトリックセンサーにします。Grx1-roGFP2センサーでは、ヒトグルタレドキシン-1(Grx1)がroGFP29,10のN末語に融合されています。RoGFP2へのGrx1酵素の共有結合は、センサーの2つの大きな改善を提供する:それはGSH / GSSGグルタチオンレドックス対(図1)に特異的なセンサー応答を作り、少なくとも100,0009の倍によってGSSGとroGFP2の間の平衡化を加速する。従って、Grx1-roGFP2は細胞グルタチオン酸化還元電位の特異的かつ動的なイメージングを可能にする。
Grx1-roGFP2イメージングは、広視野蛍光顕微鏡、回転ディスク共焦点顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡など、幅広い顕微鏡で行うことができます。一次ニューロンにおけるセンサの発現は、リポフェクション11、DNA/リン酸カルシウム共沈12、ウイルス媒介遺伝子導入、または細胞源としてのトランスジェニック動物の使用を含む様々な方法によって達成することができる(図2)。この記事では、AAV1およびAAV2キャプシドタンパク質1:1比を含む擬似型組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を使用した。このベクターを使用すると、最大センサ発現は、通常、感染後4〜5日に達し、少なくとも2週間安定した状態を保ちます。マウスやラットの一次海馬および皮質ニューロンでGrx1-roGFP2を使用しました。
本稿では、一次ラット海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2のrAAV媒介発現を用いて、基底ミトコンドリアグルタチオンレドックスの状態とその急性摂動を評価する。(i)レーザースキャン共焦点顕微鏡の設定を最適化する方法、(ii)ライブイメージング実験を実行し、(iii)FIJIを使用してデータを分析する方法についての詳細な手順を備えた共焦点ライブイメージング用のプロトコルが提供されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

ミトコンドリアレドックスホメオスタシスは、神経の生存率と機能のために重要です.ミトコンドリアには複数のレドックス系が含まれていますが、豊富なチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオンは抗酸化防御の中心的なプレーヤーと考えられています。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位を測定すると、ミトコンドリア酸化還元状態および酸化ストレスに関する有用な情報が得られます。グルタレドキシン1-roGFP2(Grx1-roGFP2)は、510nmで1つの放出ピークを有する400nmおよび490nmの2つの酸化還元状態感受性励起ピークを有するグルタチオン酸化還元電位の遺伝的にコードされた緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの比比指標である。本稿では、一次海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2の共焦点ライブ顕微鏡を行う方法について説明する。これは、定常性ミトコンドリア・グルタチオン・レドキ酸価(例えば、疾患状態または長期治療を比較する)を評価する方法と、急性治療時の酸化還元性の変化を測定する方法(興奮性薬物 N-メチル-D-アスパルテート(NMDA)を例として使用する)を説明する。さらに、この記事では、Grx1-roGFP2とミトコンドリア膜電位指標であるテトラメチルrhodamine、エチルエステル(TMRE)の共イメージングを紹介し、Grx1-roGPF2がマルチパラメトリック分析のための追加の指標でどのように多重化できるかを示します。このプロトコルは、(i)共焦点レーザー走査顕微鏡の設定を最適化する方法の詳細な説明を提供し、(ii)刺激のための薬物を適用し、その後、ジアミドとジチオトライトールによるセンサーキャリブレーション、および(iii)ImageJ / FIJIを用いてデータを分析する。

成長因子離脱後の定常ミトコンドリア酸化還元状態の違いの定量化 ミトコンドリア酸化還元状態における定常状態差の定量化を実証するために、標準培地で増殖した一次ニューロンを、イメージング前に48時間の成長因子なしで培養したニューロンと比較した。成長因子離脱は、72 h16後のアポトーシス神経細胞死をもたらす。細胞を48時間後に画像化し、これ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

本稿では、共焦点ライブ顕微鏡を用いた一次海馬および皮質ニューロンにおける急性摂動に対する基底レドックス状態と酸化還元反応の違いを判断するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、他の細胞タイプや顕微鏡に最小限の変更で適用できます。

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

この方法は、ミトコンドリア酸化還元状態が病態生理学的状態でどのように影響を受けるかを調べることができます。また、ミトコンドリアの保護を目的とした治療戦略の有効性を評価するために使用することができます。この技術の主な利点は、リアルタイムでミトコンドリア酸化還元状態の動的およびトレースの変化の器官および特異的な評価を可能にすることです。この方法は、同時に記録する追加の指標と組み合わせることができ、例えば、レドックス状態に加えてミトコンドリア膜電位またはカルシウム濃度。このプロトコルは、培養細胞、組織外植物およびスライス培養物に適用することができる。まず、走査型共焦点顕微鏡の設定を最適化します。これを行うには、検出器を12ビットまたは16ビットに設定し、シーケンシャルスキャンモードを有効にして、2番目のシーケンス/トラックを追加します。どちらのチャンネルでも、露出が少ないピクセルを示す擬似色参照テーブルを選択し、対象のオブジェクトに適した目的を選択します。細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付けます。1ミリリットルのイメージングバッファーを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。異なるピクセル形式とピンホールサイズで画像を記録します。次に、異なるレーザー強度で画像を記録し、それに応じて検出器のゲインとしきい値を調整します。最後に、異なるスキャン速度とフレーム平均の異なる数で画像を記録します。ライブイメージングの場合は、タイムラプス間隔を30秒に、持続時間を25分に設定します。次に、細胞を取り付け、顕微鏡上にチャンバーを置き、前に示したように細胞に焦点を当てます。スキャンモードに切り替え、ライブビューで488ナノメートルチャンネルを使用して、画像撮影用の細胞に焦点を当てて位置付けます。必要に応じて、1 回の実行で記録されるセルの数を増やすには、マルチポイント関数を使用して、カバースリップごとに 2 ~ 3 個の視野をイメージします。タイムラプス取得を開始し、5つの画像を2分間のベースライン記録として記録します。30マイクロモルの最終濃度を達成し、10分間のNMDA応答として追加の20画像を記録するために、3X NMDA溶液の500マイクロリットルをチャンバに加えます。次に、4X DA溶液500マイクロリットルをチャンバーに加え、さらに6枚の画像を記録します。イメージングチャンバーからバッファーを吸引し、1ミリリットルのDTT溶液に交換します。10以上の画像を記録した後、記録を終了し、画像シリーズを保存します。画像解析ソフトウェアでデータをインポートするには、プラグインをクリックし、バイオフォーマットを選択してから、バイオフォーマットのインポーターを選択します。ダイアログボックスで、ビュースタックでハイパースタックを選択し、カラーモードをデフォルトとして設定し、自動スケールを選択します。イメージをクリックし、種類を選択して 32 ビットにイメージ形式を変更し、オプションから 32 ビットを選択します。カラーチャンネルを別々のウィンドウに分割するには、画像をクリックし、色に移動して、分割チャンネルを選択します。画像をクリックし、調整としきい値を選択して、分析用のミトコンドリアを選択するためにしきい値を調整します。ダイアログボックスで、デフォルトの赤い暗い背景とスタックヒストグラムを選択します。選択したピクセルが赤く表示されたら、適用をクリックします。次に、すべての画像をナンに設定して、チャンネル2に対して同じ手順を実行するように設定します。405~488ナノメートル比を可視化するには、プロセスと画像計算機をクリックして比率画像を作成します。ダイアログ ボックスで、イメージ 2 の操作チャネル 2 で、イメージ 1 の分割でチャネル 1 を選択します。次に、[新しいウィンドウを作成]を選択し、すべての画像を処理します。イメージをクリックし、参照テーブルを選択して、イメージを疑似色に比率イメージの参照テーブルを変更し、起動します。画像を解析するには、個々の細胞またはミトコンドリアの周囲に、比率画像にROIを描画します。ROI マネージャに ROI を追加するには、分析に進み、ツールをクリックし、ROI マネージャを選択して、[追加] をクリックして [すべて表示] を選択します。個々の細胞の405〜488ナノメートルの比率を測定するには、ROIマネージャをクリックし、コントロールAを押してすべてのROIを選択し、さらに進んでマルチメジャーを選択します。ダイアログボックスで、すべてのスライスとスライスごとに 1 つの行を測定するを選択します。測定をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートした後、405ナノメートルの画像を選択し、すべてのROIの強度を測定し、再度スプレッドシートソフトウェアに測定値をエクスポートします。同様に、488ナノメートル画像のROI強度を測定します。後で参照するためにROIを保存するには、コントロールAを押してすべてのROIを選択し、さらに進んで保存を選択します。タイムラプス記録からのこれらの代表的なスナップショットは、NMDA治療の前後およびDAおよびDTTによる最大/分較正後のニューロンの比率画像を示す。30マイクロモルNMDAでのニューロンの治療は、数分以内にミトコンドリア酸化を誘導した。個々の蛍光チャネルの分析は、NMDA誘発ミトコンドリアアシドーシスが405と488ナノメートルの両方の励起にGFP蛍光の低下を引き起こしたことを明らかにした。対照実験では、DAによる前処理は、NMDAによるそれ以上のミトコンドリア酸化を排除した。したがって、405〜488比は、酸化還元感受性GFP2蛍光強度のかなりの急弱にもかかわらず変化しなかった。この実験により、405~488ナノメートル比のpH変化の影響を受けないことを確認した。別の実験では、ミトコンドリア膜電位、酸化還元状態、および形態を並行して評価した。60ミクロモルNMDAを用いたニューロンの治療は、テトラメチルRhodamineまたはTMREシグナルの損失をもたらし、405〜488ナノメートルのrho GFP比の増加に続いて、ミトコンドリアのいくつかの遅延切り上げが続いた。この方法を使用し始めるとき、慎重に顕微鏡の設定を最適化するために時間を取ることが非常に重要です。これは、あなたの実験中に神経細胞を健康に保つのに役立ちます.また、常にレーザーの安全規則を尊重することも非常に重要です。ライブ録画中に改ざんする薬物を追加する場合は、レーザー放射にさらされないようにしてください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

拡散テンソルイメージングとラクトを用いたヒト色素欠乏症における一次視覚経路で接続を測定します

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...