Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
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이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(BA 3679/5-1)에 의해 지원되었다. 2289: BA 3679/4-2). A.K.는 ERASMUS+ 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. 아이리스 뷔즈리-에레트, 리타 로스너, 안드레아 슐릭섭에게 1차 뉴런을 준비해 주셔서 감사합니다. 우리는 pLPCX- 미토 - Grx1-roGFP2를 제공 토비아스 딕 박사에게 감사드립니다. 그림 4 에 나타난 실험은 하이델베르크 대학의 니콘 이미징 센터에서 수행되었다. 도 2 는 BioRender.com 준비하였다.

모든 동물 실험은 유럽 의회의 이사회 지침 2010/63/EU를 포함하여 국가 및 제도적 지침에 부합하고, 전체 홈 오피스 윤리 승인을했다 (하이델베르크 동물 복지 사무소와 레지에룽스프라에시듐 카를스루에 대학, 라이센스 T14/21 및 T13/21). 1차 해마 및 피질 뉴런은 표준 절차에 따라 신생아 마우스 또는 쥐 새끼로부터 제조되었으며, 이전에 설명된 바와 같이 12-14일 동안 유지되었다.</p...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. 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D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

미토콘드리아 레독스 상태의 정량적이고 역동적인 측정은 미토콘드리아 및 세포 생리학에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 반응성 산소 종, "레독스 스트레스" 또는 "산화 스트레스"를 감지하는 여러 불소 화학 프로브를 사용할 수 있습니다. 그러나 후자의 용어는 잘 정의되지 않으며 종종 특이성이 부족합니다9,17,18. 화학 염?...

몇몇 중요한 미토콘드리아 효소 및 신호 분자는 티올 레독스 규정1의 적용을 받습니다. 더욱이, 미토콘드리아는 반응성 산소 종의 주요 세포 공급원이며 산화 손상에 선택적으로 취약하다2. 따라서, 미토콘드리아 레독스 전위는 생체 에너지, 세포 신호, 미토콘드리아 기능 및 궁극적으로 세포 생존가능성에 직접적인 영향을 미친다3,4. 미토콘드리아 매트릭스는 레독스 항상성을 유지하고 항산화 방어를 탑재하기 위해 티올-디설파이드 레독스 완충글루타티온(GSH)의 고량(1-15 mMM)을 함유하고 있다. GSH는 표적 단백질(S-글루타티온분해)에 공유하여 레독스 상태와 활성을 조절할 수 있으며 산화 단백질을 감소시키는 다양한 해독 효소에 의해 사용됩니다. 따라서 미토콘드리아 글루타티온 레독스 전위는 미토콘드리아 기능 및 병리생리학을 연구할 때 매우 유익한 매개 변수입니다.
roGFP2는 인공 디티올-이설화 쌍을 형성하는 두 개의 표면 노출 시스테인을 첨가하여 레독스에 민감하게 만들어진 GFP의 변종이다7,8. ~510nm에서 단일 방출 피크와 ~400 nm 및 490 nm에서 두 개의 여기 봉우리가 있습니다. 중요한 것은, 두 개의 여기 피크의 상대진폭은 roGFP2(도 1)의 레독스 상태에 따라 달라지며, 이 단백질을 비율 센서로 만듭니다. Grx1-roGFP2 센서에서 인간 글루타레독신-1(Grx1)이 roGFP29,10의 N-종자에 융합되었습니다. roGFP2에 대한 Grx1 효소의 공유 부착은 센서의 두 가지 주요 개선을 제공합니다: GSH/GSSG 글루타티온 레독스 쌍(그림 1)에 대한 센서 반응을 특정하게 만들고, GSSG와 roGFP2 간의 평형을 최소 100,0009배 이상의 비율로 가속화합니다. 따라서 Grx1-roGFP2는 세포 글루타티온 레독스 전위의 특이적이고 역동적인 이미징을 가능하게 합니다.
Grx1-roGFP2 이미징은 넓은 범위의 현미경으로 수행될 수 있으며, 여기에는 넓은 필드 형광 현미경, 회전 디스크 공초점 현미경 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경이 포함됩니다. 1차 뉴런에서 센서의 발현은 lipofection11, DNA/칼슘-인산염 인산염 인계 연수량, 바이러스 매개 유전자 전달, 또는 형질전환 동물의 세포를 세포 공급원으로 사용하는 등 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다(그림 2). AAV1 및 AAV2 캡시드 단백질 13,14의 1:1 비율을 포함하는 의사형 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)가 이 문서에서 실험을 위해 사용되었다. 이 벡터를 사용하면 최대 센서 발현은 일반적으로 감염 후 4-5 일에 도달하고 적어도 2 주 동안 안정적으로 유지됩니다. 우리는 성공적으로 마우스와 쥐에서 1 차해 및 피질 뉴런에서 Grx1-roGFP2를 사용했습니다.
이 문서에서는, 1차 쥐 해마 및 피질 뉴런에서 미토콘드리아 표적 Grx1-roGFP2의 rAAV 매개 발현은 기저 미토콘드리아 글루타티온 레독스 상태와 급성 변투를 평가하는 데 사용된다. (i) 레이저 스캐닝 공초점 현미경 설정을 최적화하는 방법에 대한 자세한 지침과 함께 공초점 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제공되며, (ii) 라이브 이미징 실험을 실행하고 (iii) FIJI와 데이터를 분석한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

미토콘드리아 레독스 항상성은 신경 생존력과 기능에 중요합니다. 미토콘드리아는 여러 레독스 시스템을 포함하고 있지만, 매우 풍부한 티올-디설파이드 레독스 버퍼 글루타티온은 항산화 방어의 핵심 선수로 간주됩니다. 따라서 미토콘드리아 글루타티온 레독스 전위를 측정하면 미토콘드리아 레독스 상태 및 산화 스트레스에 대한 유용한 정보를 제공한다. 글루타레독신1-roGFP2(Grx1-roGFP2)는 510m에서 단일 방출 피크를 가진 400nm및 490nm에서 2개의 레독스 상태 민감성 난초 피크를 가진 글루타티온 레독스 전위(GFP)-기반 의 유전자 인코딩된 녹색 형광 단백질(GFP)기반 의 비율 지표이다. 이 문서는 1 차해 및 피질 뉴런에서 미토콘드리아 표적 Grx1-roGFP2의 공초점 살아있는 현미경 검사를 수행하는 방법을 설명합니다. 그것은 정상 상태 미토콘드리아 글루타티온 redox 잠재력을 평가하는 방법을 설명 (예를 들어, 질병 상태 또는 장기 치료를 비교) 급성 치료에 레독스 변화를 측정하는 방법 (엑시토 독성 약물 N-메틸-D-아스파르타트 (NMDA를 사용하여) 예를 들어). 또한, 이 기사는 Grx1-roGFP2 및 미토콘드리아 막 전위 지표인 테트라메틸lr호다민, 에틸 에스테르(TMRE)의 공동 이미징을 제시하여 Grx1-roGPF2가 다중 파라메트릭 분석을 위한 추가 지표로 어떻게 멀티플렉스화될 수 있는지를 보여줍니다. 이 프로토콜은 (i) 공초점 레이저 스캐닝 현미경 설정을 최적화하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고, (ii) 디아미드및 디티오스레이톨로 센서 교정을 거쳐 자극을 위한 약물을 적용하고, (iii) ImageJ/FIJI로 데이터를 분석한다.

성장 인자 철수 후 정상 상태 미토콘드리아 레독스 상태의 차이의 정량화 미토콘드리아 레독스 상태에서 정상 상태 차이의 정량화를 입증하기 위해, 표준 배지에서 자란 1차 뉴런은 이미징 전에 48h의 성장 인자 없이 배양된 뉴런과 비교하였다. 성장 인자 철수 결과 후 세포 세포 죽음 72 h16. 세포는 이것이 미토콘드리아 레독스 상태의 변화에 선행되는 경우에 시험?...

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Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

이 방법은 미토콘드리아 레독스 상태가 병리학 적 조건에서 영향을받는 방법을 조사 할 수 있습니다. 그것은 또한 미토 콘 드리 아 보호에 목표로 치료 전략의 효능을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 레독스 상태에 대한 동적 및 추적 변화의 장기 및 특정 평가를 실시간으로 허용한다는 것입니다.이 방법은 레독스 상태 이외에 미토콘드리아 막 전위 또는 칼슘 농도와 같은 추가 지표와 동시에 기록될 수 있다. 이 프로토콜은 배양 세포, 조직 각성 및 슬라이스 배양에 적용될 수 있습니다. 먼저 스캐닝 공초점 현미경 설정을 최적화합니다.이렇게 하려면 검출기를 12비트 또는 16비트로 설정하고 순차 적 스캔 모드를 활성화하고 두 번째 시퀀스 /트랙을 추가합니다. 두 채널모두 노출이 부족한 픽셀을 나타내는 의사 색상 조회 테이블을 선택한 다음 관심 대상에 적합한 목표를 선택합니다. 화상 진찰실에 세포가 있는 덮개 전표를 마운트합니다.이미징 버퍼 1밀리리터를 추가하고 현미경에 챔버를 놓습니다. 접안렌즈와 전염된 빛을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 픽셀 형식과 핀홀 크기가 다른 이미지를 기록합니다.그런 다음 다른 레이저 강도로 이미지를 기록하고 그에 따라 검출기 게인 및 임계 값을 조정합니다. 마지막으로, 다른 스캔 속도와 프레임 평균의 다른 숫자로 이미지를 기록합니다. 라이브 이미징의 경우 타임랩스 간격을 30초로 설정하고 지속 시간을 25분으로 설정합니다.그런 다음 세포를 장착하고, 현미경에 챔버를 배치하고 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 집중합니다. 스캐닝 모드로 전환하고 라이브 뷰에서 488 나노미터 채널을 사용하여 이미징을 위한 세포를 집중하고 찾습니다. 선택적으로, 실행당 기록된 셀수를 늘리려면 다중 점 함수를 사용하여 커버슬립당 2~3개의 뷰 필드를 이미지화합니다.타임랩스 수집을 시작하고 5개의 이미지를 2분 베이스라인 레코딩으로 기록합니다. 챔버에 3X NMDA 용액 500마이크로리터를 추가하여 30 마이크로몰러의 최종 농도를 달성하고 10분 NMDA 응답으로 20개의 이미지를 추가로 기록합니다. 다음으로, 챔버에 4X DA 솔루션의 500 마이크로리터를 추가하고 6 개의 이미지를 더 기록합니다.이미징 챔버에서 버퍼를 흡인하고 DTT 용액의 1밀리리터로 대체합니다. 10개의 이미지를 더 녹음한 후 레코딩을 종료하고 이미지 시리즈를 저장합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 가져오면 플러그인을 클릭하고 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 포맷 가져오기를 선택합니다.대화 상자에서 뷰 스택에서 하이퍼스택을 선택하고 색상 모드를 기본값으로 설정하고 자동 축척을 선택합니다. 이미지를 클릭하고, 유형을 선택한 다음, 옵션에서 32비트로 이미지 형식을 변경합니다. 색상 채널을 별도의 창으로 분할하려면 이미지를 클릭하고 색상으로 이동하여 분할 채널을 선택합니다.임계값을 조정하여 이미지를 클릭하여 분석을 위해 미토콘드리아를 선택하고 조정 및 임계값을 선택합니다. 대화 상자에서 기본 빨간색 어두운 배경을 선택하고 히스토그램을 스택합니다. 선택한 픽셀이 빨간색으로 표시되면 적용을 클릭합니다.그런 다음 NAN에 설정된 배경 픽셀을 선택하여 모든 이미지를 처리하고 채널 2에 대해 동일한 절차를 수행합니다. 405 ~ 488 나노미터 비율을 시각화하려면 공정 및 이미지 계산기를 클릭하여 비율 이미지를 만듭니다. 대화 상자에서 이미지 2에서 동작 채널 2에서 하나의 분할이미지에서 채널 1을 선택합니다.그런 다음 새 창 만들기를 선택하고 모든 이미지를 처리합니다. 이미지를 클릭하고 조회 테이블을 선택한 다음 불면 비율 이미지의 조회 테이블을 의사 색상으로 변경합니다. 이미지를 분석하기 위해, 비율 이미지에 개별 세포 또는 미토콘드리아 주위에 ROI를 그립니다.ROI 관리자에 ROI를 추가하려면 분석하려면 도구를 클릭하고 ROI 관리자를 선택하고 추가를 클릭하고 모두 표시를 선택합니다. 개별 셀의 405 ~ 488 나노미터 비율을 측정하려면 ROI 관리자를 클릭하고 제어 A를 눌러 모든 ROI를 선택하고 더 많은 것으로 이동하여 다중 측정을 선택합니다. 대화 상자에서 슬라이스당 모든 슬라이스와 행 을 측정합니다.측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 내보낸 후 405나노미터 이미지를 선택하고 모든 ROI의 강도를 측정한 다음 측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 다시 내보냅니다. 마찬가지로, 488 나노미터 이미지의 ROI 강도를 측정한다. 향후 참조를 위해 ROI를 저장하려면 제어 A를 눌러 모든 RO를 선택하고 더 많이 이동하여 저장을 선택합니다.타임랩스 기록에서 이러한 대표적인 스냅샷은 NMDA 치료 전후뉴런의 비율 이미지와 DA 및 DTT로 최대/최소 교정 후의 비율을 보여줍니다. 30 마이크로 몰러 NMDA를 가진 뉴런의 처리는 몇 분 안에 미토콘드리아 산화를 유도합니다. 개별 형광 채널의 분석은 NMDA 유도미토콘드리아 산성증이 405 및 488 나노미터 흥분모두에 GFP 형광의 한 방울을 일으키는 원인이 되었다는 것을 밝혔습니다.대조군 실험에서, DA를 가진 pretreatment는 NMDA에 의하여 어떤 추가 미토콘드리아 산화를 배제했습니다. 따라서, 405 대 488 비율은 레독스에 민감한 GFP2 형광 강도의 상당한 담금질에도 불구하고 변하지 않았다. 본 실험은 405~488나노미터 비율이 pH 변화에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.별도의 실험에서 미토콘드리아 막 전위, 레독스 상태 및 형태학이 병렬로 평가되었다. 60 마이크로몰라 NMDA를 가진 뉴런의 처리는 테트라메틸lrhodamine 또는 TMRE 신호의 손실 및 405에서 488 나노미터 로GFP 비율에 있는 증가 귀착되었습니다 미토콘드리아의 몇몇 지연된 반올림에 선행되었습니다. 이 방법을 사용하기 시작하면 미세 설정을 신중하게 최적화하는 데 시간이 걸리는 것이 매우 중요합니다.이것은 당신의 실험 하는 동안 건강 한 뉴런을 유지 하는 데 도움이 됩니다. 또한 항상 레이저 안전 규칙을 존중하는 것이 매우 중요합니다. 라이브 녹화 중에 약물을 조작할 때 레이저 방사선에 노출되지 않도록 하십시오.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

연구

신경과학

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

확산 텐서 영상 및 Tractography를 사용하여 인간의 백색증의 기본 시각 통로에 연결 측정

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...