Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes av et ERASMUS+-stipend. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for utarbeidelsen av primære nevroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for å ha levert pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 ble utført ved Nikon Imaging Center, University of Heidelberg. Figur 2 ble utarbeidet med BioRender.com.

Alle dyreforsøk i samsvar med nasjonale og institusjonelle retningslinjer, inkludert Rådsdirektivet 2010/63/EU i Europaparlamentet, og hadde full hjemmekontor etisk godkjenning (University of Heidelberg Animal Welfare Office og Regierungspraesidium Karlsruhe, lisenser T14/21 og T13/21). Primære hippocampale og kortikale nevroner ble tilberedt fra nyfødte mus- eller rottevalper i henhold til standardprosedyrer og ble opprettholdt i 12-14 dager som tidligere beskrevet13.
<p class="jove_title...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Kvantitative og dynamiske målinger av mitokondrie-redokstilstanden gir viktig informasjon om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kjemiske sonder er tilgjengelige som oppdager reaktive oksygenarter, "redoksstress" eller "oksidativt stress". De sistnevnte begrepene er imidlertid ikke veldefinerte og mangler ofte spesifisitet9,17,18. Sammenlignet med kjemiske fargestoffer, tilbyr Grx1-roGFP2 flere<sup class="xref"...

Flere viktige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt tiol redoksregulering1. Videre er mitokondrier en viktig cellulær kilde til reaktive oksygenarter og er selektivt sårbare for oksidativ skade2. Følgelig påvirker mitokondrie-redokspotensialet bioenergetikk, cellesignalering, mitokondriefunksjon og til slutt celle levedyktighet3,4. Mitokondriematrisen inneholder høye mengder (1-15 mM) av tiol-disulfid redoks buffer glutathione (GSH) for å opprettholde redoks homeostase og montere antioksidantforsvar5,6. GSH kan kovalent festes til målproteiner (S-glutathionylation) for å kontrollere deres redoksstatus og aktivitet og brukes av en rekke avgiftende enzymer som reduserer oksiderte proteiner. Derfor er mitokondrieglutathione redokspotensialet en svært informativ parameter når du studerer mitokondriefunksjon og patofysiologi.
roGFP2 er en variant av GFP som har blitt gjort redoksensitiv ved tilsetning av to overflateutsatte cysteiner som danner et kunstig dithiol-disulfidpar7,8. Den har en enkelt utslippstopp på ~ 510 nm og to eksitasjonstopper på ~ 400 nm og 490 nm. Det er viktig at de relative amplitudene til de to eksitasjonstoppene avhenger av redokstilstanden til roGFP2 (figur 1), noe som gjør dette proteinet til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2-sensoren har human glutaredoxin-1 (Grx1) blitt smeltet sammen til N-terminus av roGFP29,10. Kovalent festing av Grx1-enzymet til roGFP2 gir to store forbedringer av sensoren: det gjør sensorresponsen spesifikk for GSH / GSSG-glutathione-redoksparet (figur 1), og det øker likevekten mellom GSSG og roGFP2 med en faktor på minst 100,0009. Grx1-roGFP2 muliggjør derfor spesifikk og dynamisk avbildning av det cellulære glutathione-redokspotensialet.
Grx1-roGFP2-avbildning kan utføres på et bredt spekter av mikroskoper, inkludert widefield fluorescensmikroskoper, roterende skivekonfokale mikroskoper og laserskanning av konfokale mikroskoper. Uttrykk for sensoren i primære nevroner kan oppnås ved ulike metoder som inkluderer lipofeksjon11, DNA/kalsiumfosfatkopecipitation12, virusmediert genoverføring eller bruk av transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotypede rekombinante adeno-assosierte virus (rAAV) som inneholder et 1:1-forhold mellom AAV1 og AAV2 kapsidproteiner 13,14 ble brukt til forsøkene i denne artikkelen. Med denne vektoren oppnås maksimal sensoruttrykk vanligvis 4-5 dager etter infeksjon og holder seg stabil i minst to uker. Vi har med hell brukt Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale nevroner fra mus og rotter.
I denne artikkelen brukes rAAV-mediert uttrykk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale nevroner til å vurdere basal mitokondrie-glutathione redokstilstand og dens akutte perturbasjon. En protokoll er gitt for konfokal live bildebehandling med detaljerte instruksjoner om hvordan du (i) optimaliserer laserskanning konfokale mikroskopinnstillinger, (ii) kjører et live bildebehandlingseksperiment og (iii) analyserer data med FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Mitokondrie redoks homeostase er viktig for nevronal levedyktighet og funksjon. Selv om mitokondrier inneholder flere redokssystemer, anses den svært rikelige tiol-disulfid-redoksbufferglutsionen som en sentral aktør i antioksidantforsvar. Derfor gir måling av mitokondrieglutathione redokspotensial nyttig informasjon om mitokondrie-redoksstatus og oksidativt stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-basert forholdsmålingsindikator for glutathione redokspotensialet som har to redoks-tilstandssensitive eksitasjonstopper på 400 nm og 490 nm med en enkelt utslippstopp på 510 nm. Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører konfekt levende mikroskopi av mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale nevroner. Den beskriver hvordan man vurderer steady-state mitokondrie-redoksuspotensial (f.eks. for å sammenligne sykdomstilstander eller langsiktige behandlinger) og hvordan man måler redoksendringer ved akutte behandlinger (ved hjelp av det eksytoksiske stoffet N-metyl-D-aspartat (NMDA) som eksempel). I tillegg presenterer artikkelen co-imaging av Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotensialindikatoren, tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), for å demonstrere hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplekses med tilleggsindikatorer for multiparametriske analyser. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du (i) optimaliserer konfokale laserskanningsmikroskopinnstillinger, (ii) bruker legemidler for stimulering etterfulgt av sensorkalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.

Kvantifisering av forskjeller i steady-state mitokondrie-redokstilstand etter tilbaketrekking av vekstfaktor For å demonstrere kvantifiseringen av steady-state forskjeller i mitokondrie redoks tilstand, ble primære nevroner dyrket i standard medium sammenlignet med nevroner dyrket uten vekstfaktorer i 48 timer før avbildning. Vekstfaktoruttak resulterer i apoptotisk nevroncelledød etter 72 h16. Celler ble avbildet etter 48 timer for å teste om dette innledes med endringer ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å bestemme forskjeller i basal redokstilstand og redoksresponser på akutte perturbasjoner i primære hippocampale og kortikale nevroner ved hjelp av konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan brukes på andre celletyper og mikroskoper med minimale modifikasjoner.

Levende bildebehandling av mitokondrieglutathione-redokstilstanden i primære nevroner ved hjelp av en ratiometrisk indikator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Denne metoden gjør det mulig å undersøke hvordan mitokondrie-redokstilstand påvirkes i patofysiologiske forhold. Det kan også brukes til å vurdere effekten av behandlingsstrategier som tar sikte på å beskytte mitokondrier. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater et organ og spesifikk vurdering av dynamiske og sporende endringer på mitokondrier redokstilstand i sanntid.Denne metoden kan kombineres med flere indikatorer for samtidig registrering, for eksempel mitokondriemembranpotensial eller kalsiumkonsentrasjoner i tillegg til redokstilstand. Denne protokollen kan brukes på kulturceller, vevsutløp og skivekulturer. Begynn med å optimalisere innstillingene for konfikalt mikroskop.For å gjøre dette, sett detektoren til 12 biter eller 16 biter, aktiver sekvensiell skannemodus og legg til en annen sekvens / spor. For begge kanalene velger du en oppslagstabell for pseudofarger som angir over- og undereksponerte bildepunkter, og deretter velger du en målsetting som passer for det aderente objektet. Monter en deksle med celler inn i bildekammeret.Tilsett en milliliter bildebuffer og plasser kammeret på mikroskopet. Bruk okularet og det overførte lyset til å fokusere cellene. Ta opp bilder med forskjellige pikselformater og pinhole-størrelser.Ta deretter opp bilder med forskjellige laserintensiteter og juster dermed detektorforsterkningen og terskelen. Til slutt tar du opp bilder med forskjellige skannehastigheter og forskjellige antall rammegjennomsnitt. For levende bildebehandling setter du tidsforløpsintervallet til 30 sekunder og varigheten til 25 minutter.Monter deretter cellene, plasser kammeret på mikroskopet og fokuser cellene som vist tidligere. Bytt til skannemodus og bruk 488 nanometerkanalen i live view for å fokusere og finne cellene for avbildning. Hvis du vil øke antall registrerte celler per kjøring, kan du eventuelt bruke flerpunktsfunksjonen til å bilde to til tre synsfelt per omslag.Start tidsforløpanskaffelsen og ta opp fem bilder som en to-minutters basislinjeopptak. Tilsett 500 mikroliter 3X NMDA-løsning i kammeret for å oppnå den endelige konsentrasjonen på 30 mikromolar og ta opp ytterligere 20 bilder som en 10-minutters NMDA-respons. Deretter legger du til 500 mikroliter 4X DA-løsning i kammeret og tar opp seks bilder til.Aspirer bufferen fra bildekammeret og erstatt den med en milliliter DTT-løsning. Etter å ha spilt inn 10 flere bilder, avslutter du innspillingen og lagrer bildeserien. For å importere dataene i bildeanalyseprogramvaren, klikk på plugins, velg bioformater og deretter bioformatimportør.I dialogboksen velger du hyperstakk i visningsstakken med, angir fargemodus som standard og velger automatisk skalering. Endre bildeformatet til 32 biter ved å klikke på bildet, velge type, og velg deretter 32-biters fra alternativene. For å dele fargekanalene i separate vinduer, klikk på bildet, gå til farge og velg delte kanaler.Juster terskelen for å velge mitokondriene for analyse ved å klikke på bildet, velge justering og terskelverdi. Velg standard rød, mørk bakgrunn i dialogboksen, og stable histogrammet. Når de merkede bildepunktene ser røde ut, klikker du på bruk.Velg deretter sett bakgrunnspiksler til NAN behandle alle bilder og utfør samme prosedyre for kanal to. For å visualisere forholdet mellom 405 og 488 nanometer, lag et forholdsbilde ved å klikke på prosess- og bildekalkulator. I dialogboksen velger du kanal én i bilde én deling i operasjonskanal to i bilde to.Velg deretter opprett nytt vindu og behandle alle bilder. Endre oppslagstabellen for forholdsbildet til pseudofargen ved å klikke på bildet, velge oppslagstabeller og deretter starte. Hvis du vil analysere bildet, tegner du ROIer rundt enkeltceller eller mitokondrier på forholdsbildet.For å legge til ROI-ene i ROI manager, gå til analyser, klikk på verktøyene, velg ROI manager, klikk på legg til og velg vis alle. For å måle 405 til 488 nanometerforhold for individuelle celler, klikk på ROI manager, velg alle ROIer ved å trykke på Kontroll A, gå til mer og velg multi-measure. Merk av for mål alle stykker og én rad per stykke i dialogboksen .Etter å ha eksportert målingene til regnearkprogramvaren, velger du 405 nanometerbildet, måler intensitetene til alle ROIer og eksporterer igjen målingene til regnearkprogramvaren. På samme måte måler du ROI-intensitetene til 488 nanometerbildet. Hvis du vil lagre ROIene for fremtidig referanse, merker du alle ROIene ved å trykke kontroll A, gå til mer og velge lagre.Disse representative øyeblikksbildene fra et tidsforløpopptak viser forholdet bilder av nevroner før og etter NMDA-behandling og etter maks / min kalibrering med DA og DTT. Behandling av nevronene med 30 mikromolar NMDA indusert mitokondrier oksidasjon i løpet av få minutter. Analyse av individuelle fluorescenskanaler viste at NMDA-indusert mitokondriesyreose forårsaket en dråpe GFP-fluorescens på både 405 og 488 nanometer eksitasjon.I et kontrolleksperiment utelukket forbehandling med DA ytterligere mitokondrioksidasjon av NMDA. Og følgelig endret ikke forholdet mellom 405 og 488 til tross for en betydelig slukking av redokssensensitiv GFP2-fluorescensintensitet. Dette eksperimentet bekreftet at forholdet mellom 405 og 488 nanometer ikke påvirkes av pH-endringer.I et eget eksperiment ble mitokondriemembranpotensial, redokstilstand og morfologi vurdert parallelt. Behandling av nevronene med 60 mikromolar NMDA resulterte i tap av tetrametylrhodamin eller TMRE-signal og en økning i forholdet 405 til 488 nanometer rho GFP etterfulgt av noen forsinkede avrunding av mitokondrier. Når du begynner å bruke denne metoden, er det svært viktig å ta tid å optimalisere mikroskopiske innstillinger nøye.Dette vil bidra til å holde nevronene sunne under forsøkene dine. Det er også svært viktig å alltid respektere lasersikkerhetsregler. Pass på at du ikke utsettes for laserstråling når du legger til medisiner for å tukle under liveopptak.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Utarbeidelse av Primary nevroner for å visualisere neurites i en Frozen hydrert tilstand ved hjelp av Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Måling Tilkobling i Primær Visual Pathway i Human albinisme Bruke Diffusion Tensor Imaging og Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live bilder av GLUT4 Protein menneskehandel musen primære hypothalamus nevroner bruker Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman I Vitro Live bildebehandling analysen av astrocytter-mediert fagocytose bruker pH indikator-konjugerte Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...