Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PARA 2289: BA 3679/4-2). A.K. cuenta con el apoyo de una beca ERASMUS+. Agradecemos a Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner y Andrea Schlicksupp por la preparación de las neuronas primarias. Agradecemos al Dr. Tobias Dick por proporcionar pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Los experimentos mostrados en la Figura 4 se realizaron en el Nikon Imaging Center de la Universidad de Heidelberg. La figura 2 se preparó con BioRender.com.

Todos los experimentos con animales se ajustaron a las directrices nacionales e institucionales, incluida la Directiva 2010/63/UE del Consejo del Parlamento Europeo, y contaron con la aprobación ética completa del Ministerio del Interior (Oficina de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg y Regierungspraesidium Karlsruhe, licencias T14/21 y T13/21). Las neuronas primarias del hipocampo y cortical se prepararon a partir de cachorros de ratón o rata recién nacidos de acuerdo con los procedimientos estándar y ...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Las mediciones cuantitativas y dinámicas del estado redox mitocondrial proporcionan información importante sobre la fisiología mitocondrial y celular. Hay varias sondas químicas fluorógenas disponibles que detectan especies reactivas de oxígeno, "estrés redox" o "estrés oxidativo". Sin embargo, estos últimos términos no están bien definidos y a menudo carecen de especificidad9,17,18. En comparación con los colorantes...

Varias enzimas mitocondriales importantes y moléculas de señalización están sujetas a la regulación tiol redox1. Además, las mitocondrias son una fuente celular importante de especies reactivas de oxígeno y son selectivamente vulnerables al daño oxidativo2. En consecuencia, el potencial redox mitocondrial afecta directamente a la bioenergética, la señalización celular, la función mitocondrial y, en última instancia, la viabilidad celular3,4. La matriz mitocondrial contiene altas cantidades (1-15 mM) del tampón tiol-disulfuro redox glutatión (GSH) para mantener la homeostasis redox y montar defensas antioxidantes5,6. El GSH se puede unir covalentemente a las proteínas diana (S-glutationilación) para controlar su estado y actividad redox y es utilizado por una variedad de enzimas desintoxicantes que reducen las proteínas oxidadas. Por lo tanto, el potencial redox de glutatión mitocondrial es un parámetro altamente informativo cuando se estudia la función mitocondrial y la fisiopatología.
roGFP2 es una variante de GFP que se ha hecho sensible a la redox mediante la adición de dos cisteínas expuestas a la superficie que forman un par artificial de ditiol-disulfuro7,8. Tiene un solo pico de emisión a ~510 nm y dos picos de excitación a ~400 nm y 490 nm. Es importante destacar que las amplitudes relativas de los dos picos de excitación dependen del estado redox de roGFP2 (Figura 1), lo que convierte a esta proteína en un sensor ratiométrico. En el sensor Grx1-roGFP2, la glutaredoxina-1 humana (Grx1) se ha fusionado con el extremo N de roGFP29,10. La unión covalente de la enzima Grx1 a roGFP2 ofrece dos mejoras importantes del sensor: hace que la respuesta del sensor sea específica para el par redox de glutatión GSH / GSSG (Figura 1), y acelera el equilibrio entre GSSG y roGFP2 en un factor de al menos 100,0009. Por lo tanto, Grx1-roGFP2 permite obtener imágenes específicas y dinámicas del potencial redox del glutatión celular.
Las imágenes Grx1-roGFP2 se pueden realizar en una amplia gama de microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia de campo amplio, los microscopios confocales de disco giratorio y los microscopios confocales de barrido láser. La expresión del sensor en las neuronas primarias se puede lograr mediante varios métodos que incluyen lipofección11, coprecipitación ADN/calcio-fosfato12, transferencia de genes mediada por virus o uso de animales transgénicos como fuente celular (Figura 2). Para los experimentos de este artículo se utilizaron virus adenoasociados recombinantes pseudotipados (rAAV) que contienen una proporción de 1:1 de proteínas de la cápside AAV1 y AAV2 13,14. Con este vector, la máxima expresión del sensor se alcanza típicamente 4-5 días después de la infección y se mantiene estable durante al menos dos semanas. Hemos utilizado con éxito Grx1-roGFP2 en neuronas primarias del hipocampo y cortical de ratones y ratas.
En este artículo, la expresión mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 dirigida a mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo y cortical de rata se utiliza para evaluar el estado redox de glutatión mitocondrial basal y su perturbación aguda. Se proporciona un protocolo para imágenes confocales en vivo con instrucciones detalladas sobre cómo (i) optimizar la configuración del microscopio confocal de escaneo láser, (ii) ejecutar un experimento de imágenes en vivo y (iii) analizar datos con FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

La homeostasis redox mitocondrial es importante para la viabilidad y función neuronal. Aunque las mitocondrias contienen varios sistemas redox, el muy abundante glutatión tampón redox tiol-disulfuro se considera un jugador central en las defensas antioxidantes. Por lo tanto, la medición del potencial redox de glutatión mitocondrial proporciona información útil sobre el estado redox mitocondrial y el estrés oxidativo. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) es un indicador ratiométrico basado en proteína fluorescente verde (GFP) codificado genéticamente del potencial redox de glutatión que tiene dos picos de excitación sensibles al estado redox a 400 nm y 490 nm con un solo pico de emisión a 510 nm. Este artículo describe cómo realizar una microscopía viva confocal de Grx1-roGFP2 dirigida a mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo y cortical. Describe cómo evaluar el potencial redox de glutatión mitocondrial en estado estacionario (por ejemplo, para comparar estados de enfermedad o tratamientos a largo plazo) y cómo medir los cambios redox en los tratamientos agudos (utilizando el fármaco excitotóxico N-metil-D-aspartato (NMDA) como ejemplo). Además, el artículo presenta imágenes conjuntas de Grx1-roGFP2 y el indicador de potencial de membrana mitocondrial, tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), para demostrar cómo Grx1-roGPF2 se puede multiplexar con indicadores adicionales para análisis multiparamétricos. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo (i) optimizar la configuración del microscopio de barrido láser confocal, (ii) aplicar medicamentos para la estimulación seguido de la calibración del sensor con diamida y ditiotreitol, y (iii) analizar datos con ImageJ / FIJI.

Cuantificación de las diferencias en el estado redox mitocondrial en estado estacionario después de la retirada del factor de crecimiento Para demostrar la cuantificación de las diferencias de estado estacionario en el estado redox mitocondrial, las neuronas primarias cultivadas en medio estándar se compararon con las neuronas cultivadas sin factores de crecimiento durante 48 horas antes de la obtención de imágenes. La abstinencia del factor de crecimiento resulta en la muerte celular neuronal a...

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Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Este artículo describe un protocolo para determinar las diferencias en el estado redox basal y las respuestas redox a las perturbaciones agudas en las neuronas primarias del hipocampo y cortical utilizando microscopía viva confocal. El protocolo se puede aplicar a otros tipos de células y microscopios con modificaciones mínimas.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Este método permite investigar cómo se ve afectado el estado redox mitocondrial en condiciones fisiopatológicas. También se puede utilizar para evaluar la eficacia de las estrategias de tratamiento que tienen como objetivo proteger las mitocondrias. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación orgánica y específica de los cambios dinámicos y de rastreo en el estado redox de las mitocondrias en tiempo real.Este método se puede combinar con indicadores adicionales para registrar simultáneamente, por ejemplo, el potencial de la membrana mitocondrial o las concentraciones de calcio además del estado redox. Este protocolo se puede aplicar a células de cultivo, explantes de tejidos y cultivos de rodajas. Comience por optimizar la configuración del microscopio confocal de barrido.Para hacerlo, configure el detector en 12 bits o 16 bits, active el modo de escaneo secuencial y agregue una segunda secuencia / pista. Para ambos canales, seleccione una tabla de búsqueda de pseudo color que indique píxeles sobreexpuestos y subexpuestos y, a continuación, seleccione un objetivo adecuado para el objeto de interés. Monte un coverslip con células en la cámara de imágenes.Agregue un mililitro de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio. Use el ocular y la luz transmitida para enfocar las células. Grabe imágenes con diferentes formatos de píxeles y tamaños estenopeicos.Luego grabe imágenes con diferentes intensidades láser y, en consecuencia, ajuste la ganancia y el umbral del detector. Finalmente, grabe imágenes con diferentes velocidades de escaneo y diferentes números de promedios de fotogramas. Para obtener imágenes en vivo, establezca el intervalo de lapso de tiempo en 30 segundos y la duración en 25 minutos.Luego monte las células, coloque la cámara en el microscopio y enfoque las células como se demostró anteriormente. Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nanómetros en la vista en vivo para enfocar y localizar las células para obtener imágenes. Opcionalmente, para aumentar el número de celdas grabadas por ejecución, utilice la función multipunto para obtener imágenes de dos a tres campos de visión por recubierta.Inicie la adquisición de lapso de tiempo y grabe cinco imágenes como una grabación de línea de base de dos minutos. Agregue 500 microlitros de solución 3X NMDA a la cámara para lograr la concentración final de 30 micromolares y registre 20 imágenes adicionales como una respuesta NMDA de 10 minutos. A continuación, agregue 500 microlitros de solución 4X DA a la cámara y grabe seis imágenes más.Aspire el tampón de la cámara de imágenes y reemplácelo con un mililitro de solución de TDT. Después de grabar 10 imágenes más, finalice la grabación y guarde la serie de imágenes. Para importar los datos en el software de análisis de imágenes, haga clic en complementos, seleccione formatos de biografía y luego en el importador de formatos de biografía.En el cuadro de diálogo, elija hyperstack en la pila de vistas con, establezca el modo de color como predeterminado y seleccione escala automática. Cambie el formato de la imagen a 32 bits haciendo clic en la imagen, seleccionando tipo y, a continuación, de las opciones, elija 32 bits. Para dividir los canales de color en ventanas separadas, haga clic en la imagen, vaya a color y seleccione dividir canales.Ajuste el umbral para seleccionar las mitocondrias para el análisis haciendo clic en la imagen, seleccionando ajustar y el umbral. En el cuadro de diálogo, seleccione fondo oscuro rojo predeterminado y histograma de pila. Cuando los píxeles seleccionados aparezcan en rojo, haga clic en aplicar.A continuación, seleccione establecer píxeles de fondo para que NAN procese todas las imágenes y realice el mismo procedimiento para el canal dos. Para visualizar la relación de 405 a 488 nanómetros, cree una imagen de proporción haciendo clic en la calculadora de procesos e imágenes. En el cuadro de diálogo, seleccione canal uno en la imagen una división en el canal de operación dos en la imagen dos.A continuación, seleccione crear nueva ventana y procese todas las imágenes. Cambie la tabla de búsqueda de la imagen de relación a pseudo color haciendo clic en la imagen, seleccionando tablas de búsqueda y, a continuación, dispare. Para analizar la imagen, dibuje ROI alrededor de células individuales o mitocondrias en la imagen de proporción.Para agregar los ROI al administrador de ROI, vaya a analizar, haga clic en las herramientas, seleccione el administrador de ROI, haga clic en agregar y seleccione mostrar todo. Para medir las proporciones de 405 a 488 nanómetros de celdas individuales, haga clic en el administrador de ROI, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione multimedida. En el cuadro de diálogo, seleccione medir todos los sectores y una fila por sector.Después de exportar las mediciones al software de hoja de cálculo, seleccione la imagen de 405 nanómetros, mida las intensidades de todos los ROI y vuelva a exportar las mediciones al software de hoja de cálculo. Del mismo modo, mida las intensidades de ROI de la imagen de 488 nanómetros. Para guardar los ROI para futuras referencias, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione guardar.Estas instantáneas representativas de una grabación de lapso de tiempo muestran imágenes de relación de neuronas antes y después del tratamiento con NMDA y después de la calibración máxima / min con DA y TDT. El tratamiento de las neuronas con NMDA 30 micromolares indujo la oxidación de las mitocondrias en pocos minutos. El análisis de los canales de fluorescencia individuales reveló que la acidosis mitocondrial inducida por NMDA causó una caída de la fluorescencia GFP en la excitación de 405 y 488 nanómetros.En un experimento de control, el pretratamiento con DA impidió cualquier oxidación adicional de las mitocondrias por NMDA. Y en consecuencia, la relación 405 a 488 no cambió a pesar de un enfriamiento considerable de la intensidad de fluorescencia GFP2 sensible al redox. Este experimento confirmó que la relación de 405 a 488 nanómetros no se ve afectada por los cambios de pH.En un experimento separado, el potencial de membrana mitocondrial, el estado redox y la morfología se evaluaron en paralelo. El tratamiento de las neuronas con NMDA micromolar de 60 resultó en la pérdida de la señal de tetrametilrodamina o TMRE y un aumento en la relación de GFP rho de 405 a 488 nanómetros seguida de un redondeo tardío de las mitocondrias. Cuando comience a usar este método, es muy importante tomarse el tiempo para optimizar cuidadosamente la configuración microscópica.Esto ayudará a mantener las neuronas sanas durante sus experimentos. También es muy importante respetar siempre las normas de seguridad láser. Asegúrese de no exponerse a la radiación láser cuando agregue medicamentos para manipular durante las grabaciones en vivo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Investigación

Neurociencias

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

La medición de conectividad en la vía visual primaria en albinismo humano recurriendo a imágenes de tensor de difusión y Tractografía

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Imágenes en vivo de la proteína GLUT4 trata de ratón las neuronas hipotalámica primaria utilizando microscopía de deconvolución

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...