Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FÖR 2289: BA 3679/4-2). A.K. stöds av ett Erasmus+-stipendium. Vi tackar Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner och Andrea Schlicksupp för beredningen av primära nervceller. Vi tackar Dr. Tobias Dick för att ha tillhandahållit pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Experiment som visas i figur 4 utfördes vid Nikon Imaging Center, University of Heidelberg. Figur 2 utarbetades med BioRender.com.

Alla djurförsök överensstämde med nationella och institutionella riktlinjer, inklusive Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU, och hade fullständigt etiskt godkännande från inrikesministeriet (Universitetet i Heidelbergs djurskyddsmyndighet och Regierungspraesidium Karlsruhe, licenserna T14/21 och T13/21). Primära hippocampal och när nervceller förbereddes från nyfödda mus eller råtta valpar enligt standard förfaranden och bibehölls i 12-14 dagar som tidigare beskrivits13.
<p cl...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Kvantitativa och dynamiska mätningar av mitokondriell redox tillstånd ger viktig information om mitokondriell och cellulär fysiologi. Flera fluorogena kemiska sonder finns tillgängliga som detekterar reaktiva syrearter, "redox stress" eller "oxidativ stress". De senare termerna är dock inte väldefinierade och saknar ofta specificitet9,17,18. Jämfört med kemiska färgämnen erbjuder Grx1-roGFP2 flera fö...

Flera viktiga mitokondriella enzymer och signalmolekyler är föremål för tiol redox reglering1. Dessutom är mitokondrier en viktig cellulär källa till reaktiva syrearter och är selektivt sårbara för oxidativ skada2. Följaktligen påverkar den mitokondriella redoxpotentialen direkt bioenergetik, cellsignalering, mitokondriell funktion och i slutändan cellviabilitet3,4. Mitokondriell matris innehåller höga mängder (1-15 mM) av tiool-disulfid redox buffert glutation (GSH) för att upprätthålla redox homeostas och montera antioxidant försvar5,6. GSH kan kovalent fästas på målproteiner (S-glutation) för att kontrollera deras redoxstatus och aktivitet och används av en rad avgiftande enzymer som minskar oxiderade proteiner. Därför är mitokondriell glutthione redox potential en mycket informativ parameter när man studerar mitokondriell funktion och patofysiologi.
roGFP2 är en variant av GFP som har gjorts redoxkänslig genom tillsats av två ytexponerade cysteiner som bildar ett artificiellt dithiol-disulfidpar7,8. Den har en enda utsläppstopp på ~ 510 nm och två excitationstoppar vid ~ 400 nm och 490 nm. Viktigt är att de relativa amplituderna för de två excitationstopparna beror på redoxtillståndet för roGFP2 (figur 1), vilket gör detta protein till en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2-sensorn har humant glutaredoxin-1 (Grx1) smälts till N-ändstationen för roGFP29,10. Kovalent fastsättning av Grx1-enzymet till roGFP2 ger två stora förbättringar av sensorn: det gör sensorresponsen specifik för GSH/GSSG glutations redox-paret (figur 1), och det påskyndar jämvikten mellan GSSG och roGFP2 med en faktor på minst 100 0009. Därför möjliggör Grx1-roGFP2 specifik och dynamisk avbildning av den cellulära glutationen redox potential.
Grx1-roGFP2-avbildning kan utföras på ett brett spektrum av mikroskop, inklusive widefield fluorescensmikroskop, snurrande diskkonfokala mikroskop och laserskanning konfokala mikroskop. Uttryck av sensorn i primära nervceller kan uppnås med olika metoder som inkluderar lipofection11, DNA/kalciumfosfatkoprecipitation12, virusmedierad genöverföring eller användning av transgena djur som cellkälla (figur 2). Pseudotypade rekombinanta adenoassocierade virus (rAAV) som innehåller ett 1:1-förhållande av AAV1 och AAV2 capsidproteiner 13,14 användes för experimenten i denna artikel. Med denna vektor uppnås maximal sensoruttryck vanligtvis 4-5 dagar efter infektion och förblir stabilt i minst två veckor. Vi har framgångsrikt använt Grx1-roGFP2 i primära hippocampal och när nervceller från möss och råttor.
I den här artikeln används rAAV-medierade uttryck för mitokondrier-riktade Grx1-roGFP2 i primära råtta hippocampal och när nervceller används för att bedöma basala mitokondriell glutation redox tillstånd och dess akut störtflod. Ett protokoll tillhandahålls för konfokal live imaging med detaljerade instruktioner om hur man (i) optimerar laserscanning konfokala mikroskopinställningar, (ii) kör ett live imaging experiment och (iii) analysera data med FIJI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Mitokondriell redox homeostas är viktigt för neuronal livskraft och funktion. Även om mitokondrier innehåller flera redox system, anses den mycket rikliga tiool-disulfid redox buffert glutation anses vara en central aktör i antioxidant försvar. Därför, mäta mitokondriell glutthione redox potential ger användbar information om mitokondriell redox status och oxidativ stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) är en genetiskt kodad, grön fluorescerande protein (GFP)-baserad ratiometrisk indikator på glutation redox potential som har två redox-tillståndskänsliga excitation toppar på 400 nm och 490 nm med en enda utsläppstopp på 510 nm. Denna artikel beskriver hur man utför confocal levande mikroskopi av mitokondrier-riktade Grx1-roGFP2 i primära hippocampal och när nervceller. Den beskriver hur man bedömer steady-state mitokondriell glution redox potential (t.ex. att jämföra sjukdomstillstånd eller långsiktiga behandlingar) och hur man mäter redox förändringar vid akuta behandlingar (med excitotoxiska läkemedlet N-metyl-D-aspartat (NMDA) som exempel). Dessutom presenterar artikeln co-imaging av Grx1-roGFP2 och mitokondriell membran potential indikator, tetramethylrhodamine, etylester (TMRE), för att visa hur Grx1-roGPF2 kan multiplexeras med ytterligare indikatorer för multiparametriska analyser. Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av hur man (i) optimera konfokal laserskanning mikroskop inställningar, (ii) tillämpa läkemedel för stimulering följt av sensor kalibrering med diamid och dithiothreitol, och (iii) analysera data med ImageJ /FIJI.

Kvantifiering av skillnader i steady-state mitokondriell redox tillstånd efter tillväxtfaktor tillbakadragande För att påvisa kvantifiering av steady-state skillnader i mitokondriell redox tillstånd, primära nervceller odlade i standard medium jämfördes med nervceller odlade utan tillväxtfaktorer för 48 h före imaging. Tillväxtfaktor tillbakadragande resulterar i apoptotic neuronal cell död efter 72 h16. Celler avbildades efter 48 h för att testa om detta föregå...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Denna artikel beskriver ett protokoll för att bestämma skillnader i basal redox tillstånd och redox svar på akuta störtfloder i primära hippocampal och när nervceller med confocal levande mikroskopi. Protokollet kan tillämpas på andra celltyper och mikroskop med minimala modifieringar.

Live imaging av mitokondriell glutation Redox tillstånd i primära nervceller med hjälp av en ratiometrisk indikator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Denna metod gör det möjligt att undersöka hur mitokondriell redox tillstånd påverkas i patofysiologiska förhållanden. Det kan också användas för att bedöma effekten av behandlingsstrategier som syftar till att skydda mitokondrier. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter ett organ och specifik bedömning av dynamiska och spåra förändringar på mitokondrier redox tillstånd i realtid.Denna metod kan kombineras med ytterligare indikatorer för att samtidigt registrera till exempel mitokondriell membranpotential eller kalciumkoncentrationer utöver redoxtillstånd. Detta protokoll kan tillämpas på odlingsceller, vävnadsexplanter och segmentkulturer. Börja med att optimera inställningarna för skanning av konfokala mikroskop.För att göra det ställer du in detektorn på 12 bitar eller 16 bitar, aktiverar sekventiellt skanningsläge och lägger till en andra sekvens / spår. För båda kanalerna väljer du en pseudofärgsuppslagstabell som anger över- och underexponerade pixlar och väljer sedan ett mål som är lämpligt för objektet av intresse. Montera ett täckslip med celler i bildkammaren.Tillsätt en milliliter bildbuffert och placera kammaren på mikroskopet. Använd okularet och det överförda ljuset för att fokusera cellerna. Spela in bilder med olika pixelformat och pinhole-storlekar.Spela sedan in bilder med olika laserintensiteter och justera därmed detektorns förstärkning och tröskel. Slutligen spelar du in bilder med olika skanningshastigheter och olika antal bildgenomsnitt. För live-avbildning ställer du in timelapse-intervallet till 30 sekunder och varaktigheten till 25 minuter.Montera sedan cellerna, placera kammaren på mikroskopet och fokusera cellerna som visats tidigare. Växla till skanningsläge och använd 488 nanometerskanalen i live-vyn för att fokusera och hitta cellerna för avbildning. Om du vill öka antalet inspelade celler per körning använder du funktionen flera punkter för att avbilda två till tre synfält per täckslip.Starta timelapse-förvärvet och spela in fem bilder som en två minuters baslinjeinspelning. Tillsätt 500 mikroliter 3X NMDA-lösning i kammaren för att uppnå den slutliga koncentrationen av 30 mikromolar och registrera ytterligare 20 bilder som ett 10-minuters NMDA-svar. Lägg sedan till 500 mikroliter 4X DA-lösning i kammaren och spela in ytterligare sex bilder.Aspirera bufferten från bildkammaren och ersätt den med en milliliter DTT-lösning. När du har spelat in ytterligare 10 bilder avslutar du inspelningen och sparar bildserien. För att importera data i bildanalysprogramvaran, klicka på plugins, välj bioformat och sedan bioformatimportör.Välj hyperstack i visningsstacken med i dialogrutan, ange färgläge som standard och välj automatisk skalning. Ändra bildformatet till 32 bitar genom att klicka på bilden, välja typ och välj sedan 32 bitar från alternativen. Om du vill dela upp färgkanalerna i separata fönster klickar du på bilden, går till färg och väljer delade kanaler.Justera tröskelvärdet för att välja mitokondrierna för analys genom att klicka på bilden, välja justera och tröskel. Välj standard röd mörk bakgrund och stapla histogram i dialogrutan. När de markerade pixlarna visas röda klickar du på använd.Välj sedan ange bakgrundspixlar till NAN-process alla bilder och utför samma procedur för kanal två. För att visualisera förhållandet 405 till 488 nanometer skapar du en förhållandebild genom att klicka på process- och bildkalkylatorn. I dialogrutan väljer du kanal ett i bild ett dividera i driftkanal två i bild två.Välj sedan skapa nytt fönster och bearbeta alla bilder. Ändra uppslagstabellen för förhållandebilden till pseudofärg genom att klicka på bilden, välja uppslagstabeller och sedan avfyra. För att analysera bilden ritar du ROIs runt enskilda celler eller mitokondrier på förhållandebilden.Om du vill lägga till ROIs i ROI-hanteraren går du till analys, klickar på verktygen, väljer ROI-hanteraren, klickar på lägg till och väljer visa alla. Om du vill mäta förhållandet 405 till 488 nanometer för enskilda celler klickar du på ROI-hanteraren, väljer alla ROI genom att trycka på kontroll A, gå till mer och välj flermått. Välj mått på alla segment och en rad per segment i dialogrutan.När du har exporterat mätningarna till kalkylbladsprogramvaran väljer du bilden på 405 nanometer, mäter intensiteten för alla ROU och exporterar mätningarna till kalkylbladsprogramvaran igen. Mät på samma sätt ROI-intensiteterna för bilden på 488 nanometer. Om du vill spara ROIs för framtida referens markerar du alla ROIs genom att trycka på Kontroll A, gå till mer och välja spara.Dessa representativa ögonblicksbilder från en timelapse inspelning visar förhållandet bilder av nervceller före och efter NMDA behandling och efter max/min kalibrering med DA och DTT. Behandling av nervceller med 30 mikromolar NMDA inducerad mitokondrier oxidation inom några minuter. Analys av enskilda fluorescenskanaler visade att NMDA-inducerad mitokondriell acidos orsakade en droppe GFP fluorescens på både 405 och 488 nanometer excitation.I ett kontrollexperiment förhindrade förbehandling med DA ytterligare mitokondrier oxidation av NMDA. Och följaktligen ändrades inte förhållandet 405 till 488 trots en betydande släckning av redoxkänslig GFP2 fluorescensintensitet. Detta experiment bekräftade att förhållandet 405 till 488 nanometer inte påverkas av pH-förändringar.I ett separat experiment bedömdes mitokondriell membran potential, redox tillstånd och morfologi parallellt. Behandling av nervceller med 60 mikromolar NMDA resulterade i förlust av tetrametylrhodamin eller TMRE signal och en ökning av förhållandet 405 till 488 nanometer rho GFP följt av viss fördröjd avrundning av mitokondrier. När du börjar använda den här metoden är det mycket viktigt att ta dig tid att noggrant optimera mikroskopiska inställningar.Detta hjälper till att hålla nervcellerna friska under dina experiment. Det är också mycket viktigt att alltid respektera lasersäkerhetsregler. Se till att inte utsättas för laserstrålning när du lägger till droger för manipulering under liveinspelningar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Fastställande av mitokondriell membranpotential och reaktiva syreradikaler i Live Rat kortikala Neuroner

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-märkta receptor Insättning till plasmamembranet i primärt odlade mus Nervceller

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Beredning av primär nervceller för Visualisering neuriter i en Frozen-hydrerad stat Använda Cryo-elektrontomografi

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Mätning Connectivity i Primär Visual Pathway i Human Albinism Använda Diffusion Tensor Imaging och tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging test av Astrocyten-medierad fagocytos med pH-indikator-konjugerad Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...