Name: live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; 2289 İÇİN: BA 3679/4-2). A.K. ERASMUS+ bursu ile desteklenmektedir. Birincil nöronların hazırlanması için Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner ve Andrea Schlicksupp'a teşekkür ederiz. PLPCX-mito-Grx1-roGFP2 sağladığı için Dr. Tobias Dick'e teşekkür ederiz. Şekil 4'te gösterilen deneyler Heidelberg Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi'nde gerçekleştirildi. Şekil 2 BioRender.com ile hazırlanmıştır.

Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB Konsey Direktifi de dahil olmak üzere ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olan ve tam İçişleri Bakanlığı etik onayına sahip olan tüm hayvan deneyleri (Heidelberg Üniversitesi Hayvan Refahı Ofisi ve Regierungspraesidium Karlsruhe, T14/21 ve T13/21 lisansları). Primer hipokampal ve kortikal nöronlar yenidoğan fare veya sıçan yavrularından standart prosedürlere göre hazırlandı ve daha önce tanımlandığı gibi 12-14 gün boyunca muhafaza edildi13<...

<ol>
	<li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics.">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li><li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Manfredi, G., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).</li><li>Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione,+a+key+survival+antioxidant.">Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+thiols+in+antioxidant+protection+and+redox+signaling:+distinct+roles+for+glutathionylation+and+other+thiol+modifications.">Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+intracellular+glutathione+redox+potential.">Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.</a> Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).</li><li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+E(GSH)+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes.">Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li><li>Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+in+primary+cultured+neuronal+cells.">Transfection in primary cultured neuronal cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).</li><li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=convenient,+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons.">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li><li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity.">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li><li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Zhang, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+calcium+signaling+controls+expression+of+a+large+gene+pool:+identification+of+a+gene+program+for+acquired+neuroprotection+induced+by+synaptic+activity.">Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity.</a> PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).</li><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+using+fluorescent+probes+to+detect+and+quantify+specific+reactive+oxygen+species+in+living+cells.">The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+a+concept+in+redox+biology+and+medicine.">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li><li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors.">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li><li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination.">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li><li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes.">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li><li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis.">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li><li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo.">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li><li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons.">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li><li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein.">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li><li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry.">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071 (2019).</li></ol>

Mitokondriyal redoks durumunun nicel ve dinamik ölçümleri mitokondriyal ve hücresel fizyoloji hakkında önemli bilgiler sağlar. Reaktif oksijen türlerini, "redoks stres" veya "oksidatif stresi" tespit eden çeşitli florojenik kimyasal problar mevcuttur. Bununla birlikte, ikinci terimler iyi tanımlanmamıştır ve genellikle özgüllüklerden yoksundur9,17,18. Kimyasal boyalarla karşılaştırıldığında, Grx1-roGFP2 ...

Birkaç önemli mitokondriyal enzim ve sinyal molekülü tiol redoks regülasyonuna tabidir1. Ayrıca, mitokondri reaktif oksijen türlerinin önemli bir hücresel kaynağıdır ve oksidatif hasara karşı seçici olarak savunmasızdır2. Buna göre, mitokondriyal redoks potansiyeli biyoenergetikleri, hücre sinyallerini, mitokondriyal fonksiyonu ve nihayetinde hücre canlılığını doğrudan etkiler3,4. Mitokondriyal matris, redoks homeostazını korumak ve antioksidan savunmaları monte etmek için yüksek miktarlarda (1-15 mM) tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon (GSH) içerir5,6. GSH, redoks durumlarını ve aktivitelerini kontrol etmek için hedef proteinlere (S-glutatyonilasyon) birlikte bağlanabilir ve oksitlenmiş proteinleri azaltan bir dizi detoksifiye edici enzim tarafından kullanılır. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyeli, mitokondriyal fonksiyon ve patofizyoloji incelerken oldukça bilgilendirici bir parametredir.
roGFP2, yapay bir dithiol-disülfid çifti oluşturan yüzeye maruz kalan iki sisteinin eklenmesiyle redoks duyarlı hale getirilmiş bir GFP çeşididir7,8. ~510 nm'de tek bir emisyon zirvesine ve ~400 nm ve 490 nm'de iki heyecan zirvesine sahiptir. Daha da önemlisi, iki ekscitasyon zirvesinin bağıl genlikleri roGFP2'nin redoks durumuna bağlıdır (Şekil 1), bu proteini oranmetrik bir sensör haline getirir. Grx1-roGFP2 sensöründe, insan glutaredoxin-1 (Grx1) roGFP29,10'un N-terminusu ile kaynaşmıştır. Grx1 enziminin roGFP2'ye katan bağlanması sensörün iki önemli iyileştirmesini sağlar: sensör yanıtını GSH/GSSG glutatyon redoks çiftine özgü hale getirir (Şekil 1) ve GSSG ile roGFP2 arasındaki dengeyi en az 100.0009 kat hızlandırır. Bu nedenle, Grx1-roGFP2 hücresel glutatyon redoks potansiyelinin spesifik ve dinamik görüntülenmesini sağlar.
GRX1-roGFP2 görüntüleme, geniş alan floresan mikroskopları, dönen disk konfokal mikroskopları ve lazer tarama konfokal mikroskopları dahil olmak üzere çok çeşitli mikroskoplarda yapılabilir. Birincil nöronlarda sensörün ekspresyonu lipofeksiyon11, DNA/kalsiyum-fosfat koprecipitation12, virüs aracılı gen transferi veya transgenik hayvanların hücre kaynağı olarak kullanılması gibi çeşitli yöntemlerle elde edilebilir (Şekil 2). Bu makaledeki deneyler için 1:1 AAV1 oranı ve AAV2 kapsid proteinleri 13,14 içeren sözde rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV) kullanılmıştır. Bu vektör ile maksimal sensör ekspresyonuna genellikle enfeksiyondan 4-5 gün sonra ulaşılır ve en az iki hafta stabil kalır. Grx1-roGFP2'yi fare ve sıçanlardan birincil hipokampal ve kortikal nöronlarda başarıyla kullandık.
Bu makalede, primer sıçan hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2'nin rAAV aracılı ekspresyonu bazal mitokondriyal glutatyon redoks durumunu ve akut pertürbasyonunu değerlendirmek için kullanılır. (i) lazer tarama konfokal mikroskop ayarlarının nasıl optimizeılacağı, (ii) canlı görüntüleme deneyinin nasıl çalıştırılacağı ve (iii) FIJI ile verilerin nasıl analizılacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar içeren konfokal canlı görüntüleme için bir protokol sağlanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamide (DA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6908.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (2.5 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-4522.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442611-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>neoFroxx GmbH</td>
			<td>LC-5932.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (0.1 M stock solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Life Imaging Services (Basel, Switzerland)</td>
			<td>10920</td>
			<td>Ludin Chamber Type 3 for &#216;12mm coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PP1080 181-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-02 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, incubationsystem</td>
			<td>TokaiHit</td>
			<td>INU-ZILCF-F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning disc confocal microscope, scanning unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StackReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg plugin</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the mitochondrial glutathione redox state in primary neurons using a ratiometric indicator

Mitokondriyal redoks homeostaz nöronal canlılık ve fonksiyon için önemlidir. Mitokondri birkaç redoks sistemi içermese de, oldukça bol miktarda tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon antioksidan savunmada merkezi bir oyuncu olarak kabul edilir. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin ölçülmesi mitokondriyal redoks durumu ve oksidatif stres hakkında yararlı bilgiler sağlar. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2), 400 nm ve 490 nm'de tek emisyon zirvesi olan iki redoks durumuna duyarlı uyarlama zirvesine sahip glutatyon redoks potansiyelinin genetik olarak kodlanmış, yeşil floresan protein (GFP) bazlı bir oransal göstergesidir. Bu makalede primer hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2 konfokal canlı mikroskopinin nasıl gerçekleştirilği açıklanmaktadır. Sabit durum mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin (örneğin, hastalık durumlarını veya uzun süreli tedavileri karşılaştırmak için) nasıl değerlendirileceğini ve akut tedavilerde redoks değişikliklerinin nasıl ölçüleceğini (örnek olarak ekssostoksik ilaç N-metil-D-aspartat (NMDA) kullanılarak) açıklar. Buna ek olarak, makale Grx1-roGFP2 ve mitokondriyal membran potansiyel göstergesi, tetrametrikrhodamin, etil ester (TMRE), Grx1-roGPF2'nin çok boyutlu analizler için ek göstergelerle nasıl çok sayıdan olabileceğini göstermek için ortak görüntüleme sunar. Bu protokol, (i) konfokal lazer tarama mikroskop ayarlarının nasıl optimize edilmesi, (ii) uyarılma için ilaçların nasıl uygulanacağı ve ardından diamid ve dithiothreitol ile sensör kalibrasyonunun nasıl uygulanacağı ve (iii) ImageJ/FIJI ile verilerin nasıl analiz edilmesi gerektiği hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar.

Büyüme faktörü geri çekilmesinden sonra sabit durum mitokondriyal redoks durumundaki farklılıkların ölçülmesi Mitokondriyal redoks durumundaki sabit durum farklılıklarının nicelliğini göstermek için, standart ortamda yetişen primer nöronlar, görüntülemeden önce 48 saat boyunca büyüme faktörü olmadan kültürlenen nöronlarla karşılaştırıldı. Büyüme faktörü çekilmesi 72 h16'dan sonra apoptotik nöronal hücre ölümü ile sonuçlanır. Hüc...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator at JoVE.com

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Bu yöntem, mitokondriyal redoks durumunun patofizyolojik koşullarda nasıl etkilendiğini araştırmayı sağlar. Mitokondrileri korumayı amaçlayan tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondri redoks durumundaki dinamik ve izleme değişikliklerinin gerçek zamanlı olarak bir organ ve spesifik değerlendirmesine izin ver olmasıdır.Bu yöntem, redoks durumuna ek olarak mitokondriyal membran potansiyelini veya kalsiyum konsantrasyonlarını aynı anda kaydetmek için ek göstergelerle birleştirilebilir. Bu protokol kültür hücrelerine, doku eksplantlarına ve dilim kültürlerine uygulanabilir. Tarama konfokal mikroskop ayarlarını optimize ederek başlayın.Bunu yapmak için dedektörü 12 bit veya 16 bit olarak ayarlayın, sıralı tarama modunu etkinleştirin ve ikinci bir sıra/parça ekleyin. Her iki kanal için de, aşırı ve az pozlanmış pikselleri gösteren sahte bir renk arama tablosu seçin ve ardından ilgi çekici nesneye uygun bir hedef seçin. Görüntüleme odasına hücreli bir kapak kapağı takın.Bir mililitre görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskop üzerine yerleştirin. Hücreleri odaklamak için göz merceği ve iletilen ışığı kullanın. Farklı piksel formatları ve iğne deliği boyutlarıyla görüntüleri kaydedin.Ardından farklı lazer yoğunluklarına sahip görüntüler kaydedin ve buna göre dedektör kazancını ve eşiğini ayarlayın. Son olarak, farklı tarama hızlarına ve farklı kare ortalamalarına sahip görüntüler kaydedin. Canlı görüntüleme için zaman çakışma aralığını 30 saniyeye ve süreyi 25 dakikaya ayarlayın.Daha sonra hücreleri monte edin, odayı mikroskop üzerine yerleştirin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi odaklayın. Tarama moduna geçin ve görüntüleme hücrelerini odaklamak ve bulmak için canlı görünümdeki 488 nanometre kanalını kullanın. İsteğe bağlı olarak, çalışma başına kaydedilen hücre sayısını artırmak için, kapak altlığı başına iki ila üç görünüm alanını görüntülemek için çok noktalı işlevi kullanın.Timelapse alımını başlatın ve beş görüntüyi iki dakikalık temel kayıt olarak kaydedin. 30 mikromolar son konsantrasyonu elde etmek için odaya 500 mikrolitre 3X NMDA çözeltisi ekleyin ve 10 dakikalık NMDA yanıtı olarak ek 20 görüntü kaydedin. Ardından, odaya 500 mikrolitre 4X DA çözeltisi ekleyin ve altı görüntü daha kaydedin.Tamponu görüntüleme odasından epire edin ve bir mililitre DTT çözeltisi ile değiştirin. 10 resim daha kaydettikten sonra kaydı sonlandırın ve görüntü serisini kaydedin. Görüntü analiz yazılımındaki verileri içe aktarmak için eklentilere tıklayın, biyo formatları seçin ve ardından biyo formatları içe aktarıcı.iletişim kutusunda, görünüm yığınında hipersack'i seçin, renk modunu varsayılan olarak ayarlayın ve otomatik ölçekle'yi seçin. Görüntüye tıklayarak, türü seçerek ve seçeneklerden 32 bit'i seçerek görüntü biçimini 32 bit olarak değiştirin. Renk kanallarını ayrı pencerelere bölmek için görüntüyü tıklatın, renge gidin ve bölünmüş kanalları seçin.Görüntüyü tıklatarak, ayarla ve eşik'i seçerek analiz için mitokondriyi seçmek için eşiği ayarlayın. iletişim kutusunda, varsayılan kırmızı koyu arka planı seçin ve histogramı yığın. Seçili pikseller kırmızı göründüğünde Uygula'ya tıklayın.Ardından, tüm görüntüleri NAN işlemek için arka plan piksellerini ayarla'yı seçin ve kanal iki için aynı yordamı uygulayın. 405 ila 488 nanometre oranını görselleştirmek için işlem ve görüntü hesaplayıcısına tıklayarak bir oran görüntüsü oluşturun. iletişim kutusunda, görüntüde bir kanal bir bölmeyi seçin, ikinci görüntüde ikinci işlem kanalında bölün.Ardından yeni pencere oluştur'u seçin ve tüm görüntüleri işleyin. Görüntüyü tıklatıp arama tablolarını seçip ateş ederek oran görüntüsünün arama tablosunu sahte renge değiştirin. Görüntüyü analiz etmek için, tek tek hücrelerin etrafına RBI'ler veya oran görüntüsüne mitokondri çizin.Roi'leri yatırım getirisi yöneticisine eklemek için analize gidin, araçlara tıklayın, yatırım getirisi yöneticisini seçin, ekle'ye tıklayın ve tümlerini göster'i seçin. Tek tek hücrelerin 405 ila 488 nanometre oranlarını ölçmek için yatırım getirisi yöneticisine tıklayın, Kontrol A tuşuna basarak tüm ROI'leri seçin, daha fazlasına gidin ve çok ölçülü seçin. iletişim kutusunda, tüm dilimleri ve her dilimde bir satırı ölç'ü seçin.Ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarmanın ardından, 405 nanometre görüntüsünü seçin, tüm ROI'lerin yoğunluklarını ölçün ve ölçümleri yine elektronik tablo yazılımına dışa aktarın. Benzer şekilde, 488 nanometre görüntüsünün yatırım getirisi yoğunluklarını ölçün. ROI'leri ileride başvurmak üzere kaydetmek için, A Denetimi'ne basarak tüm ROI'leri seçin, daha fazlasına gidin ve kaydet'i seçin.Bir timelapse kaydından elde edilen bu temsili anlık görüntüler, NMDA tedavisinden önce ve sonra ve DA ve DTT ile maksimum / en az kalibrasyondan sonra nöronların oran görüntülerini gösterir. Nöronların birkaç dakika içinde 30 mikromoler NMDA indüklenmiş mitokondri oksidasyonu ile tedavisi. Bireysel floresan kanallarının analizi, NMDA kaynaklı mitokondriyal asidozun hem 405 hem de 488 nanometre eksize edicide bir damla GFP floresansına neden olduğunu ortaya koydu.Bir kontrol deneyinde, DA ile ön işlem, NMDA tarafından daha fazla mitokondri oksidasyonunu önledi. Ve buna göre, 405 ila 488 oranı, redoksa duyarlı GFP2 floresan yoğunluğunun önemli ölçüde söndürülmesine rağmen değişmedi. Bu deney, 405 ila 488 nanometre oranının pH değişikliklerini etkilemediğini doğruladı.Ayrı bir deneyde mitokondriyal membran potansiyeli, redoks durumu ve morfoloji paralel olarak değerlendirildi. Nöronların 60 mikromoler NMDA ile tedavisi tetrametrilrhodamin veya TMRE sinyalinin kaybına ve 405 ila 488 nanometre rho GFP oranında bir artışa ve ardından mitokondrilerin gecikmeli toplanmasına neden oldu. Bu yöntemi kullanmaya başladığınızda, mikroskobik ayarları dikkatlice optimize etmek için zaman ayırarak çok önemlidir.Bu, deneyleriniz sırasında nöronların sağlıklı kalmasına yardımcı olacaktır. Lazer güvenlik kurallarına her zaman riayet etmek de çok önemlidir. Canlı kayıtlar sırasında kurcalamak için ilaç eklerken lazer radyasyona maruz kalmadığınızdan emin olun.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

Difüzyon tensör görüntüleme ve traktografi kullanarak İnsan Albinizmi İlköğretim Görsel Yolu&#39;ndaki Bağlantı Ölçme

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...