Name: ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل من خلال منحة Wellcome 206401 / Z / 17 / Z. نود أن نشكر ظفر بشير على إرشاده الخبير والدكتورة كلير بوث على المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة.

وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة (1986) والمبادئ التوجيهية المرتبطة به فضلا عن المبادئ التوجيهية المؤسسية المحلية.
1. الحقن الفيروسي المجسمة
ملاحظة: يتطلب البروتوكول الحالي خصوصية ت...

<ol>
	<li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li><li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas.">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons.">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li><li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning.">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network.">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex.">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices.">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li><li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents.">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li><li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions.">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens/rhomboid+nuclei+and+hippocampus.">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers.">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li><li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat.">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li><li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex.">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception.">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li><li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes+1,+8,+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport.">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li><li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species.">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li><li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations.">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses.">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li><li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality.">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li></ol>

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة لاستكشاف إسقاطات متشابكة طويلة المدى محددة للغاية باستخدام مزيج من الجراحة المجسمة لتقديم AAVs التي تشفر التركيبات البصرية الجينية ، والفيزيولوجيا الكهربية في شرائح الدماغ الحادة (الشكل 1). توفر هذه التقنيات مجتمعة أدوات لتوصيف فسيولوجيا و...

إن فهم فسيولوجيا نقاط الاشتباك العصبي وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية أمر أساسي لفهم كيفية عمل شبكات الدماغ في الدماغ السليم1 ، وكيف تتعطل في اضطرابات الدماغ. يسمح استخدام شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي بتسجيل النشاط الكهربائي للمشابك العصبية من الخلايا العصبية المفردة ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية باستخدام تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة. يسمح التحكم في إمكانات الغشاء والتلاعب الدوائي المباشر بعزل الأنواع الفرعية للمستقبلات. يمكن إجراء هذه التسجيلات بخصوصية رائعة لتحديد الخلايا العصبية ما بعد المشبكي ، بما في ذلك الموضع الرقائقي ودون الإقليمي2 ، والمورفولوجيا الخلوية3 ، ووجود علامات جزيئية4 ، وإسقاطاتهاالقريبة 5 ، أو حتى إذا كانت نشطة مؤخرا6.
ومع ذلك ، فإن تحقيق خصوصية المدخلات قبل المشبكي هو أكثر تحديا إلى حد ما. استخدمت الطريقة التقليدية أقطاب التحفيز لإثارة المحاور العصبية التي تعمل في صفيحة معينة. مثال على ذلك هو في الحصين حيث يقوم التحفيز المحلي في الطبقة الراديوية بتنشيط نقاط الاشتباك العصبي التي تنتقل من CA3 إلى الحقل الفرعي CA17. في هذه الحالة ، يتم تحقيق خصوصية ما قبل المشبكي حيث يمثل إدخال CA3 الإدخال المثير الوحيد الموجود داخل الطبقة المشعة التي تعرض على الخلايا الهرمية CA18. ومع ذلك ، فإن هذه الدرجة العالية من خصوصية المدخلات التي يمكن تحقيقها من خلال التنشيط الكهربائي التقليدي قبل المشبكي لمحاور CA3-CA1 هي استثناء ينعكس في الدراسة المكثفة التي خضع لها هذا المشبك. في مناطق الدماغ الأخرى ، تتعايش المحاور العصبية من مسارات متعددة في نفس الصفيحة ، على سبيل المثال ، في الطبقة 1 من القشرة المخية الجديدة9 ، مما يجعل التحفيز قبل المشبكي الخاص بالمدخلات مستحيلا مع أقطاب التحفيز التقليدية. هذا أمر إشكالي لأن المدخلات المشبكية المختلفة قد يكون لها خصائص فسيولوجية متباينة. لذلك ، قد يؤدي التحفيز المشترك إلى سوء توصيف علم وظائف الأعضاء المتشابك.
سمح ظهور علم البصريات الوراثي ، وهو الترميز الجيني لبروتينات الغشاء الحساسة للضوء (opsins) مثل channelrhodopsin-2 (ChR2) ، بتوسيع واسع في إمكانيات دراسة الإسقاطات المشبكية المعزولة بين مناطق الدماغ10,11. هنا نصف حلا قابلا للتعميم ومنخفض التكلفة لدراسة فسيولوجيا المشبكية طويلة المدى واللدونة. يتم تسليم التركيبات البصرية الجينية بطريقة محددة للغاية باستخدام ناقلات فيروسية تسمح بالتحكم الدقيق للغاية في المنطقة ما قبل المشبكي ذات الاهتمام. سوف تعبر الإسقاطات الساطعة عن القناة المنشطة بالضوء مما يسمح بتنشيط هذه الألياف في المنطقة المستهدفة. وبالتالي ، يمكن دراسة المسارات طويلة المدى والمنتشرة تشريحيا والتي لا يمكن تنشيطها بشكل مستقل عن طريق التحفيز الكهربائي التقليدي غير المحدد.
نحن نصف ، على سبيل المثال المسار ، نقل قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) مع الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAVs) التي تشفر opsins قناة الكاتيون المثيرة. ثم نصف إعداد شرائح حادة من القشرة الداخلية الجانبية (LEC) ، وتسجيلات المشبك الرقعة من الخلايا العصبية الهرمية LEC من الطبقة 5 ، والتنشيط الخفيف لإسقاطات mPFC-LEC الغلوتاماتية (الشكل 1). كما نصف التقييم النسيجي لموقع الحقن لتأكيد موقع المنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية وتحديد مورفولوجيا الخلايا ما بعد المشبكية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tube</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>12134102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way luer valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30600-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine (DAB) substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PLN4X/0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35512</td>
			<td>Viral titre: 3.3x1013 GC/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>49363</td>
			<td>Focusses visual spectrum and near-IR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005*</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera - Qimaging Retiga Electro</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>01-ELECTRO-M-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbachol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetasept</td>
			<td>XHG008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Andis</td>
			<td>22445</td>
			<td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimation condenser lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ACL2520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10011913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Rapid Electronics Ltd</td>
			<td>84-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6341 BNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 500 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 600 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with side port</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>895150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET570/20x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paint brush</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BRU2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>30% (w/w)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic fluorescence filter cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DFM1T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine ointment</td>
			<td>Teva</td>
			<td>80007150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted blue LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted green LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M565L3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaGTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR LED</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>SFH4550</td>
			<td>Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RAYLLAMB/OCT</td>
			<td>Optimal cutting temperature medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Ministar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>23-769-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-26-GH/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder for micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>OPMI 1 FR pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter for intracellular recording solution</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin citrate</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10458842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinLTP</td>
			<td>https://www.winltp.com/</td>
			<td>Version 2.32</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular?</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex

تعد دراسة الخصائص الفسيولوجية لنقاط الاشتباك العصبي المحددة في الدماغ ، وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية ، تحديا رئيسيا في علم الأعصاب الحديث. تستخدم التقنيات الكهروفسيولوجية التقليدية في المختبر التحفيز الكهربائي لإثارة النقل المشبكي. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو طبيعتها غير المحددة. سيتم تنشيط جميع المحاور العصبية في منطقة القطب المحفز ، مما يجعل من الصعب عزو تأثير إلى اتصال معين قريب. يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استبدال التحفيز الكهربائي بالتحفيز القائم على البصريات الوراثية. نحن نصف طريقة للجمع بين علم البصريات الوراثي وتسجيلات المشبك في المختبر . هذه أداة قوية لدراسة كل من الانتقال المشبكي القاعدي واللدونة المشبكية للروابط المشبكية المحددة تشريحيا بدقة وتنطبق على أي مسار تقريبا في الدماغ. هنا ، نصف إعداد ومعالجة بروتين ناقل فيروسي يشفر قناة رودوبسين للحقن الجراحي في منطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية (قشرة الفص الجبهي الإنسية) في دماغ القوارض وصنع شرائح حادة من المناطق المستهدفة في المصب (القشرة الأنفية الجانبية). كما يتم تقديم إجراء مفصل للجمع بين تسجيلات المشبك التصحيحي والتنشيط المشبكي عن طريق التحفيز الضوئي لدراسة اللدونة المشبكية على المدى القصير والطويل. نناقش أمثلة على التجارب التي تحقق خصوصية المسار والخلية من خلال الجمع بين علم البصريات الوراثي ووضع العلامات على الخلايا المعتمدة على Cre. وأخيرا ، يتم وصف التأكيد النسيجي للمنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات البيوسيتين للخلية ما بعد المشبكية ، للسماح بمزيد من التحديد للموقع الدقيق ونوع الخلية.

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية دراسة فسيولوجيا المشبكية طويلة المدى واللدونة باستخدام التسليم الفيروسي للبنى البصرية الوراثية. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة أي اتصال طويل المدى تقريبا في الدماغ. على سبيل المثال ، نصف حقن AAVs التي تشفر opsin في mPFC الفئران ، وإعداد شرائح حادة من LEC ، وتسجي...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

تسمح التركيبات البصرية الوراثية التي يتم تسليمها فيروسيا بالتوصيف الكهربي التفصيلي لعلم وظائف الأعضاء واللدونة لنقاط الاشتباك العصبي المحددة في شرائح الدماغ الحادة. تتمثل المزايا الأساسية لتنشيط نقاط الاشتباك العصبي بصريا في القدرة على دراسة المسارات طويلة المدى ، والتحفيز الانتقائي للمحاور العصبية غير المنفصلة تشريحيا. ستوضح الإجراء الدكتورة ليزا كينافان ، باحثة مشاركة من مختبرنا.للبدء ، قم بتحميل حقنة هاملتون في مضخة حقنة حقن مجهرية متصلة بذراع متحرك مثبت على إطار مجسم. ثم ضع حصة من الفيروس بحجم خمسة ميكرولتر في جهاز طرد مركزي دقيق. أدر الأنبوب لبضع ثوان وماصة اثنين ميكرولتر من المستحضر الفيروسي في غطاء الأنبوب.لملء المحقنة بالمستحضر الفيروسي ، شاهد طرف الإبرة بمجهر جراحي. ثم ضع بلعة الفيروس يدويا على طرف الإبرة ، واسحب مكبس المحقنة باستخدام أدوات التحكم في المضخة. اضبط حجم حقن المضخة على 300 نانولتر ومعدل التدفق على 100 نانولتر في الدقيقة.قم بتشغيل المضخة وتأكيد التدفق السليم من خلال مراقبة قطرة الفيروس عند طرف الإبرة. امتصاص الفيروس على برعم القطن ، وتنظيف الإبرة مع 70 ٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، باستخدام مسامير الضبط الموجودة على الإطار المجسم ، انتقل إلى طرف الإبرة إلى bregma ، ولاحظ القياسات المجسمة التي لوحظت على موازين الورنية الثلاثة على الإطار.اجمع أو اطرح هذه المسافات من إحداثيات bregma. اصنع ثقبا في سطح الجمجمة باستخدام مثقاب دقيق مثبت على الذراع المجسم. أدخل الإبرة في الدماغ عند الإحداثي الظهري البطني المحدد مسبقا ، وبث حجم محدد مسبقا من المستحضر الفيروسي.بعد التسريب، اترك الإبرة في الموقع لمدة 10 دقائق للسماح بانتشار البلعة. ثم قم بإزالة الإبرة ، وقم بتشغيل المضخة للتأكد من عدم انسداد الإبرة. بعد أسبوعين من الحقن الفيروسي ، قم بالقتل الرحيم للفأر ، وتشريح الدماغ بالكامل بسرعة ، ونقله إلى محلول قطع السكروز.باستخدام ملعقة صغيرة معدنية ، التقط الدماغ ، وتخلص من المحلول الزائد ، وضعه على ورقة ترشيح. باستخدام مشرط ، قم بإزالة المخيخ ، وقطع المخ في المستوى الإكليلي في منتصف طوله تقريبا. النصف الخلفي هو كتلة الأنسجة LEC.أعد كتلة الأنسجة والدماغ المتبقي إلى محلول قطع السكروز. بعد ذلك ، ضع قطرة من غراء cyanoacrylate على مرحلة اهتزازية ، وانشرها في طبقة رقيقة. ثم باستخدام ملعقة صغيرة ، اختر كتلة أنسجة LEC ، وانقلها إلى رقعة الغراء ، بحيث يلتصق القطع الإكليلي الأمامي.قم بتثبيت المرحلة في غرفة الأنسجة الاهتزازية ، وصب بسرعة محلول قطع السكروز الكافي لغمر الأنسجة. بعد توجيه السطح البطني لكتلة الأنسجة نحو الشفرة ، قم بقص شرائح بسمك 350 ميكرومتر من البطني إلى الظهري باستخدام سرعة تقدم بطيئة للشفرة. عادة ، يمكن الحصول على سبع شرائح لكل نصف الكرة الأرضية.انقل الشرائح إلى غرفة تجميع الشرائح. ثم ضع غرفة التجميع في حمام مائي 34 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل العودة إلى درجة حرارة الغرفة. ضع ما تبقى من الدماغ في بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة.لتحديد الخلية المستهدفة ، ضع الشريحة في غرفة التسجيل ، وشل حركتها باستخدام مرساة شريحة. تحت التكبير المنخفض ، باستخدام إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، انتقل إلى طبقة LEC الخامسة. ثم قم بالتغيير إلى هدف الغمر المائي عالي التكبير ، وحدد الخلايا العصبية الهرمية.حدد موضع الخلية على الشاشة بشريط. بعد ذلك ، لتشكيل مشبك تصحيح خلية كاملة ، قم بتصنيع ماصة دقيقة من زجاج البورسليكات ، واملأها بمحلول التسجيل داخل الخلايا. ضع الماصة الدقيقة المملوءة في حامل القطب الكهربائي وقم بتطبيق ضغط إيجابي عن طريق النفخ بقوة في قطعة الفم المتصلة بالمنفذ الجانبي لحامل القطب الكهربائي.ارفع هدف المجهر بحيث يتشكل الغضروف المفصلي وأدخل القطب في الغضروف المفصلي حتى يمكن رؤيته على المجهر. افتح نافذة اختبار الختم ، وحدد ما إذا كانت مقاومة الماصة من ثلاثة إلى خمسة ميغا أوم. ثم المس الخلية المحددة بطرف ماصة ، مما يؤدي إلى مسافة بادئة في غشاء الخلية.بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط سلبي عن طريق الشفط في لسان حال الفم ، مما يزيد من مقاومة الماصة. استمر في تطبيق الضغط السلبي تدريجيا حتى يتمزق غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى عابرة سعة الخلية بأكملها. للدخول إلى تكوين المشبك الحالي ، استخدم مصباح LED مثبتا موجها إلى مسار ضوء المجهر مع مكعبات المرشح والبصريات المناسبة ، وقم بتطبيق نبضات ضوئية على الشريحة عبر هدف 40X.قم بتوصيل قطارات من نبضات ضوئية متعددة بسرعة خمسة هرتز و 10 هرتز و 20 هرتز للتحقيق في خصائص الإطلاق قبل المشبكي. للسماح للخلية الحيوية بملء الخلايا العصبية ، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد إدخال تكوين الخلية بأكملها. في مشبك الجهد ، راقب سعة الغشاء ومقاومة الإدخال.ثم اسحب الماصة ببطء على طول زاوية الاقتراب بعيدا عن سوما الخلية ، مع ملاحظة الاختفاء البطيء لعابري السعة وتيار الغشاء ، مما يشير إلى إعادة إغلاق غشاء الخلية وتشكيل رقعة خارجية للخارج عند طرف الماصة. ضع الشريحة في بارافورمالدهيد في طبق من 24 بئرا واحتضانها طوال الليل. باستخدام وسيط OCT ، قم بتوصيل كتلة الأنسجة بقرص عينة cryostat.لتجميد الأنسجة ، ضع الأيزوبنتان في حاوية مناسبة واغمر قرص العينة ، وتأكد من أن الأنسجة أعلى من مستوى الأيزوبنتان. ثم اخفض حاوية الأيزوبنتان إلى نيتروجين سائل ، واترك الأنسجة تتجمد. بمجرد تجميد الأنسجة تماما ، اترك كتلة الأنسجة في غرفة التبريد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة للسماح بتوازن درجة حرارة الكتلة.بعد التوازن ، قم بقص أقسام بسمك 40 ميكرومتر في cryostat ، واستخدم فرشاة رسم دقيقة لتوجيه الأقسام بعيدا عن الشفرة. قم بلصق هذه الأقسام المجمدة على شريحة مجهر زجاجي مطلي بالبولي L-lysine بدرجة حرارة الغرفة عن طريق لمس الشريحة إلى الأقسام. بعد إضافة 150 ميكرولتر من وسط التركيب إلى كل شريحة ، ضع زلة الغطاء ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء بالضغط برفق على انزلاق الغطاء.قم بتغطية الشرائح للحماية من التبييض الضوئي ، واتركها تجف في الهواء لمدة 12 ساعة. ثم باستخدام مجهر مضان ، افحص موقع موقع الحقن الفيروسي. لتلطيخ البيوسيتين ، احتضن الشرائح في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في PBS لمدة 30 دقيقة لمنع أي نشاط بيروكسيديز داخلي.ثم اغسل شرائح الدماغ باستخدام برنامج تلفزيوني حتى لا تظهر فقاعات أكسجين أخرى. بعد ذلك ، احتضن الشرائح لمدة ثلاث ساعات في محلول HRP 1٪ من الأفيدين والبيوتينيل في PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100. بعد ست عمليات غسل PBS ، احتضن كل شريحة في محلول DAB حتى يصبح تلطيخ الخلايا الحيوية للهياكل العصبية مرئيا.أوقف التفاعل عن طريق نقل الشرائح في PBS الباردة. ثم قم بتركيب الشرائح على شرائح المجهر الزجاجي باستخدام فرشاة. بعد إزالة PBS الزائدة ، أضف وسيط التركيب.غطي الشرائح باستخدام زلات الغطاء واتركيها تجف في الهواء ، كما هو موضح سابقا. تم تحديد موقع خلية هرمية صحية ومصححة. إذا كان تحديد الخلية بعد المشبكي مطلوبا ، فيجب تحديد الخلية التي تعبر عن علامة الفلورسنت باستخدام بصريات واسعة المجال.أدت نبضات الضوء المفردة التي تبلغ ميلي ثانية إلى إمكانات استثارة بصرية وراثية بسيطة بعد المشبكية. يتم فحص اللدونة قصيرة المدى للمشبك من خلال تطبيق خمسة و 10 و 20 هيرتز من التحفيز الضوئي. أثناء التحقيق في اللدونة على المدى الطويل ، تسببت إضافة كارباكول ناهض الكوليني إلى aCSF المنتشر لمدة 10 دقائق في انخفاض طويل الأمد كان لا يزال واضحا بعد 40 دقيقة من إزالة الرباط.تم فحص طول موقع الحقن من الناحية النسيجية. تم توطين المراسل الفلوري mCherry في الطبقات العميقة من القشرة الأولية وتحت الحمراء. علاوة على ذلك ، أكد تلطيخ خلية مملوءة بالحيوية موقعها ومورفولوجيتها.تتمثل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في النقل الدقيق لمنطقة الدماغ الواردة ، والتي يمكن التحقق منها بعد ذلك ، والتشريح السريع للدماغ عند تحضير الشرائح الحادة. يتم دمج هذا الإجراء بسهولة مع وضع العلامات الفلورية لنوع خلية فردي ، مثل فئة فرعية معينة من الخلايا العصبية البينية. لفعل ذلك، سنستخدم حيوانا محورا وراثيا يعبر عن إنزيم إعادة الاتحاد في هذا النوع المحدد من الخلايا.سمحت التركيبات البصرية الوراثية التي يتم تسليمها فيروسيا بالتقدم السريع في مجالات الأنظمة وعلم الأعصاب الدائرة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

ربط الاستجابات السلوكية لإشارات الرنين المغناطيسي الوظيفي من قشرة الفص الجبهي الإنسان: دراسة العمليات المعرفية عن طريق تحليل المهمة

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:<em&gt; خارج الحي</em&gt; رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

إعداد شرائح مجاور للسهمي للتحقيق في ظهري، بطني منظمة من القشرة المخية الأنفية الداخلية القوارض الإنسي

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

نموذج الماوس إشعال الناجمة عن بينتيلينيتيترازولي

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

التحفيز المغناطيسي Transcranial مجتمعة والمخ من قشرة Dorsolateral Prefrontal

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...