Name: ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door Wellcome grant 206401/Z/17/Z. We willen Zafar Bashir bedanken voor zijn deskundige mentorschap en Dr. Clair Booth voor technische assistentie en commentaar op het manuscript.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Britse Animals Scientific Procedures Act (1986) en bijbehorende richtlijnen en lokale institutionele richtlijnen.
1. Stereotaxische virale injectie
OPMERKING: Het huidige protocol vereist anatomische, maar niet post-synaptische celtype, specificiteit.
<ol><li>Kies het juiste dier. Mannelijke wild-type Lister hooded ratten werden gebruikt in dit protocol (300-350 g, ongeveer 3 maanden ...

<ol>
	<li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li><li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas.">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons.">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li><li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning.">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network.">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex.">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices.">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li><li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents.">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li><li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions.">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens/rhomboid+nuclei+and+hippocampus.">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers.">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li><li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat.">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li><li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex.">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception.">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li><li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes+1,+8,+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport.">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li><li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species.">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li><li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations.">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses.">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li><li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality.">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li></ol>

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om zeer specifieke synaptische projecties op lange afstand te onderzoeken met behulp van een combinatie van stereotaxische chirurgie om AAV's te leveren die coderen voor optogenetische constructies, en elektrofysiologie in acute hersensegmenten (figuur 1). Samen bieden deze technieken hulpmiddelen om de fysiologie en plasticiteit van hersencircuits met hoge precisie te karakteriseren in langeafstands- en anatomisch diffuse paden die voo...

Het begrijpen van de fysiologie van synapsen en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is van fundamenteel belang om te begrijpen hoe hersennetwerken functioneren in de gezonde hersenen1 en hoe ze niet goed functioneren bij hersenaandoeningen. Het gebruik van acute ex vivo hersensegmenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van synapsen van afzonderlijke neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding te registreren met behulp van patchklemopnamen voor hele cellen. Controle van membraanpotentiaal en eenvoudige farmacologische manipulatie maakt isolatie van receptorsubtypen mogelijk. Deze opnames kunnen met voortreffelijke specificiteit worden gemaakt om het post-synaptische neuron te identificeren, inclusief laminaire en subregionale positie2, cellulaire morfologie3, aanwezigheid van moleculaire markers4, de afferente projecties5, of zelfs als het onlangs actief was6.
Het bereiken van specificiteit van pre-synaptische inputs is echter iets uitdagender. De conventionele methode heeft stimulatie-elektroden gebruikt om de axonen te exciteren die in een bepaalde lamina lopen. Een voorbeeld hiervan is in de hippocampus waar lokale stimulatie in het stratum radiatum synapsen activeert die van de CA3 naar het CA1-subveld7 projecteren. In dit geval wordt presynaptische specificiteit bereikt omdat CA3-input de enige exciterende input vertegenwoordigt die zich in stratum radiatum bevindt en projecteert op CA1 piramidale cellen8. Deze hoge mate van inputspecificiteit die haalbaar is met conventionele elektrische presynaptische activering van CA3-CA1-axonen is echter een uitzondering die wordt weerspiegeld in de intense studie waaraan deze synaps is onderworpen. In andere hersengebieden bestaan axonen van meerdere afferente paden naast elkaar in dezelfde lamina, bijvoorbeeld in laag 1 van neocortex9, waardoor inputspecifieke presynaptische stimulatie onmogelijk wordt met conventionele stimulerende elektroden. Dit is problematisch omdat verschillende synaptische inputs uiteenlopende fysiologische eigenschappen kunnen hebben; daarom kan hun co-stimulatie leiden tot verkeerde karakterisering van synaptische fysiologie.
De komst van optogenetica, de genetische codering van lichtgevoelige membraaneiwitten (opsins) zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), heeft een enorme uitbreiding van de mogelijkheden mogelijk gemaakt voor het bestuderen van geïsoleerde synaptische projecties tussen hersengebieden10,11. Hier beschrijven we een generaliseerbare en goedkope oplossing voor het bestuderen van synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand. De optogenetische constructen worden op een zeer specifieke manier geleverd met behulp van virale vectoren die een uiterst nauwkeurige controle van het pre-synaptische gebied van belang mogelijk maken. Efferente projecties zullen het door licht geactiveerde kanaal uitdrukken, waardoor deze vezels in een doelgebied kunnen worden geactiveerd. Zo kunnen langeafstands-, anatomisch diffuse paden worden bestudeerd die niet onafhankelijk kunnen worden geactiveerd door traditionele, niet-specifieke, elektrische stimulatie.
We beschrijven, als voorbeeldroute, transductie van mediale prefrontale cortex (mPFC) met adeno-geassocieerde virussen (AAV's) die coderen voor exciterende kationkanaalopsinen. Vervolgens beschrijven we de bereiding van acute plakjes uit de laterale entorhinale cortex (LEC), patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevooleerde activering van glutamaterge mPFC-LEC projecties (Figuur 1). We beschrijven ook de histologische beoordeling van de injectieplaats om de locatie van het pre-synaptische gebied van belang en identificatie van post-synaptische celmorfologie te bevestigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tube</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>12134102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way luer valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30600-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine (DAB) substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PLN4X/0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35512</td>
			<td>Viral titre: 3.3x1013 GC/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>49363</td>
			<td>Focusses visual spectrum and near-IR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005*</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera - Qimaging Retiga Electro</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>01-ELECTRO-M-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbachol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetasept</td>
			<td>XHG008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Andis</td>
			<td>22445</td>
			<td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimation condenser lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ACL2520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10011913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Rapid Electronics Ltd</td>
			<td>84-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6341 BNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 500 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 600 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with side port</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>895150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET570/20x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paint brush</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BRU2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>30% (w/w)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic fluorescence filter cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DFM1T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine ointment</td>
			<td>Teva</td>
			<td>80007150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted blue LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted green LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M565L3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaGTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR LED</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>SFH4550</td>
			<td>Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RAYLLAMB/OCT</td>
			<td>Optimal cutting temperature medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Ministar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>23-769-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-26-GH/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder for micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>OPMI 1 FR pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter for intracellular recording solution</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin citrate</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10458842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinLTP</td>
			<td>https://www.winltp.com/</td>
			<td>Version 2.32</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular?</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex

Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen van specifieke synapsen in de hersenen, en hoe ze plastische veranderingen ondergaan, is een belangrijke uitdaging in de moderne neurowetenschappen. Traditionele in vitro elektrofysiologische technieken gebruiken elektrische stimulatie om synaptische transmissie op te roepen. Een groot nadeel van deze methode is het niet-specifieke karakter; alle axonen in het gebied van de stimulerende elektrode worden geactiveerd, waardoor het moeilijk is om een effect toe te schrijven aan een bepaalde afferente verbinding. Dit probleem kan worden ondervangen door elektrische stimulatie te vervangen door optogenetische stimulatie. We beschrijven een methode om optogenetica te combineren met in vitro patch-clamp opnames. Dit is een krachtig hulpmiddel voor de studie van zowel basale synaptische transmissie als synaptische plasticiteit van precieze anatomisch gedefinieerde synaptische verbindingen en is van toepassing op bijna elke route in de hersenen. Hier beschrijven we de voorbereiding en behandeling van een virale vector die codeert voor channelrhodopsine-eiwit voor chirurgische injectie in een pre-synaptisch gebied van belang (mediale prefrontale cortex) in de hersenen van knaagdieren en het maken van acute plakjes stroomafwaartse doelgebieden (laterale entorhinale cortex). Een gedetailleerde procedure voor het combineren van patch-clamp opnames met synaptische activering door lichtstimulatie om synaptische plasticiteit op korte en lange termijn te bestuderen, wordt ook gepresenteerd. We bespreken voorbeelden van experimenten die pathway- en celspecificiteit bereiken door optogenetica en Cre-afhankelijke celetikettering te combineren. Ten slotte wordt histologische bevestiging van het pre-synaptische gebied van belang beschreven samen met biocytine-etikettering van de post-synaptische cel, om verdere identificatie van de precieze locatie en het celtype mogelijk te maken.

In dit protocol beschrijven we hoe we synaptische fysiologie en plasticiteit op lange afstand kunnen bestuderen met behulp van virale afgifte van optogenetische constructen. Het protocol kan heel gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van bijna elke langeafstandsverbinding in de hersenen. Als voorbeeld beschrijven we de injectie van AAV's die coderen voor een opsine in rat mPFC, de bereiding van acute plakjes van LEC, patch-clamp opnames van laag 5 LEC piramidale neuronen en lichtgevoceerde activering van mPFC-t...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Viraal geleverde optogenetische constructies maken gedetailleerde elektrofysiologische karakterisering van de fysiologie en plasticiteit van specifieke synapsen in acute hersensegmenten mogelijk. De belangrijkste voordelen van het activeren van synapsen optogenetisch is het vermogen om langeafstandsroutes te bestuderen en de selectieve stimulatie van axonen die niet anatomisch gescheiden zijn. Dr.Lisa Kinnavane, een onderzoeksmedewerker van ons laboratorium, demonstreert de procedure.Om te beginnen laadt u een Hamilton-spuit in een pomp met micro-injectiespuit die is bevestigd aan een beweegbare arm die is gemonteerd op een stereotaxisch frame. Plaats vervolgens een aliquot van vijf microliter van het virus in een microcentrifuge. Draai de buis een paar seconden en pipetteer twee microliter van het virale preparaat in het deksel van de buis.Om de spuit te vullen met het virale preparaat, bekijkt u de naaldpunt met een chirurgische microscoop. Plaats vervolgens handmatig de bolus van het virus op de punt van de naald en trek de zuiger van de spuit op met behulp van de pompbedieningen. Stel het injectievolume van de pomp in op 300 nanoliter en het debiet op 100 nanoliter per minuut.Laat de pomp draaien en bevestig de juiste stroom door de druppel van het virus aan de naaldpunt te observeren. Absorbeer het virus op een wattenstaafje en maak de naald schoon met 70% ethanol. Navigeer vervolgens met behulp van de stelschroeven op het stereotaxische frame de naaldpunt naar de bregma en let op de stereotaxische metingen die zijn waargenomen op de drie vernier-schalen op het frame.Tel deze afstanden op of trek ze af van de bregmacoördinaten. Maak een braamgat aan het schedeloppervlak met behulp van een microboor die op de stereotaxische arm is gemonteerd. Steek de naald in de hersenen bij de vooraf bepaalde dorsoventrale coördinaat en infundeer een vooraf bepaald volume van het virale preparaat.Laat de naald na infusie 10 minuten in situ om de diffusie van de bolus mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de naald en laat de pomp draaien om ervoor te zorgen dat de naald niet wordt geblokkeerd. Twee weken na de virale injectie, euthanaseer de rat, ontleed snel de hele hersenen en breng het over in de sucrose-snijoplossing.Pak met een metalen theelepel de hersenen op, gooi de overtollige oplossing weg en plaats deze op een filterpapier. Verwijder met behulp van een scalpel het cerebellum en snijd het cerebrum in het coronale vlak ongeveer halverwege de lengte. De achterste helft is het LEC-weefselblok.Breng het weefselblok en de resterende hersenen terug naar de sucrosesnijoplossing. Plaats vervolgens een druppel cyanoacrylaatlijm op een vibratomstadium en verspreid deze in een dunne laag. Gebruik vervolgens een theelepel, pluk het LEC-weefselblok en breng het over op de lijmpleister, zodat de voorste coronale snede is gehecht.Installeer het podium in de vibratome weefselkamer en giet snel voldoende sucrose-snijoplossing om het weefsel onder te dompelen. Nadat u het ventrale oppervlak van het weefselblok naar het mes hebt gericht, snijdt u 350 micrometer dikke plakken van ventraal naar dorsaal met behulp van een langzame bladvoortgangssnelheid. Meestal kunnen zeven plakjes per halfrond worden verkregen.Breng de segmenten over naar de segmentverzamelingskamer. Plaats vervolgens de verzamelkamer een uur in een waterbad van 34 graden Celsius voordat u terugkeert naar kamertemperatuur. Plaats de rest van de hersenen gedurende 48 uur in paraformaldehyde.Voor de identificatie van de doelcel plaatst u het segment in de opnamekamer en immobiliseert u het met een segmentanker. Navigeer onder lage vergroting, met behulp van infraroodverlichting, naar de LEC-laag vijf. Schakel vervolgens over naar het hoge vergrotingsdoel voor onderdompeling in water en identificeer de piramidale neuronen.Markeer de positie van de cel op de monitor met tape. Om vervolgens een hele celpleisterklem te vormen, fabriceert u een micropipet van borosilicaatglas en vult u deze met een intracellulaire opnameoplossing. Plaats de gevulde micropipet in de elektrodehouder en oefen positieve druk uit door hard te blazen in een mondstuk dat is aangesloten op de zijpoort van de elektrodehouder.Verhoog het microscoopdoel zodanig dat zich een meniscus vormt en steek de elektrode in de meniscus totdat deze op de microscoop te zien is. Open het venster Seal Test en bepaal of de pipetweerstand drie tot vijf megaohms is. Raak vervolgens de geïdentificeerde cel aan met een pipetpunt, wat resulteert in een inkeping in het celmembraan.Pas vervolgens negatieve druk uit door aan te zuigen op het mondstuk, waardoor de weerstand van de pipet toeneemt. Blijf geleidelijk negatieve druk uitoefenen totdat het celmembraan scheurt, wat resulteert in transiënten van de capaciteit van de hele cel. Om de huidige klemconfiguratie te openen, gebruikt u een gemonteerde LED die in het microscooplichtpad is gericht met filterkubussen en geschikte optiek en past u lichtpulsen toe op de plak via het 40X-objectief.Lever treinen van meerdere lichtpulsen op vijf hertz, 10 hertz en 20 hertz om de presynaptische afgifte-eigenschappen te onderzoeken. Om biocytine in staat te stellen het neuron te vullen, wacht u ten minste 15 minuten na het invoeren van de hele celconfiguratie. Controleer bij spanningsklem de membraancapaciteit en ingangsweerstand.Trek vervolgens langzaam de pipet terug langs de naderingshoek weg van de soma van de cel, waarbij de langzame verdwijning van capaciteitstransiënten en membraanstroom wordt waargenomen, wat wijst op de herdichting van het celmembraan en de vorming van een buitenste pleister aan de pipetpunt. Doe de plak in paraformaldehyde in een 24-wells plaat en incubeer een nacht. Bevestig met oct-medium een weefselblok aan de cryostaatmonsterschijf.Om het weefsel te bevriezen, plaatst u isopentane in een geschikte container en dompelt u de monsterschijf onder, zodat het weefsel boven het niveau van het isopentaan ligt. Laat vervolgens de container met isopentane zakken tot vloeibare stikstof en laat het weefsel bevriezen. Zodra het weefsel volledig is bevroren, laat u het weefselblok gedurende 30 minuten in de cryostaatkamer op min 20 graden Celsius staan om de temperatuur van het blok in evenwicht te brengen.Snijd na equilibratie 40 micrometer dikke secties in de cryostaat en gebruik een fijne kwast om de secties van het mes te leiden. Bevestig deze bevroren secties aan een poly-L-lysine-gecoate glazen microscoopglaas op kamertemperatuur door de dia aan de secties aan te raken. Nadat u 150 microliter montagemedium aan elke dia hebt toegevoegd, brengt u de afdekslip aan en verwijdert u eventuele luchtbellen door voorzichtig op de afdekslip te drukken.Bedek de dia's ter bescherming tegen fotobleaching en laat ze 12 uur aan de lucht drogen. Onderzoek vervolgens met behulp van een fluorescentiemicroscoop de locatie van de virale injectieplaats. Voor biocytinekleuring incubeer de plakjes in 3% waterstofperoxide in PBS gedurende 30 minuten om eventuele endogene peroxidase-activiteit te blokkeren.Was vervolgens de hersenplakken met PBS totdat er geen zuurstofbellen meer zichtbaar zijn. Incubeer vervolgens de plakjes gedurende drie uur in 1% avidine-gebiotinyleerde HRP-complexoplossing in PBS met 0,1% Triton X-100. Na zes PBS-wasbeurten incubeert u elke plak in DAB-oplossing totdat de biocytinekleuring van neuronale structuren zichtbaar wordt.Stop de reactie door de plakjes over te brengen in koude PBS. Monteer vervolgens de plakjes op de glasmicroscoopglaasjes met een borstel. Voeg na het verwijderen van overtollige PBS het montagemedium toe.Bedek de plakjes met afdekglijders en laat ze aan de lucht drogen, zoals eerder aangetoond. Een gezonde piramidale cel werd gelokaliseerd en gepatcht. Als post-synaptische celidentificatie vereist is, moet een cel die de fluorescerende marker tot expressie brengt, worden gelokaliseerd met behulp van widefield-optica.Enkele lichtpulsen van twee milliseconden resulteerden in eenvoudige golfvorm optogenetische excitatorische post-synaptische potentialen. De plasticiteit van de synaps op korte termijn wordt onderzocht door vijf, 10 en 20 hertz-treinen van lichtstimulatie toe te passen. Tijdens het onderzoeken van plasticiteit op lange termijn, veroorzaakte het toevoegen van cholinerge agonist carbachol aan de circulerende aCSF gedurende 10 minuten een langdurige depressie die 40 minuten na verwijdering van het ligand nog steeds duidelijk was.De lengte van de injectieplaats werd histologisch onderzocht. De fluorescerende verslaggever mCherry was gelokaliseerd in de diepere lagen van de prelimbische en infralimbische cortex. Verder bevestigde het kleuren van een met biocytine gevulde cel de locatie en morfologie.De kritieke stappen van dit protocol zijn nauwkeurige transductie van het afferente hersengebied, dat post hoc kan worden geverifieerd, en snelle dissectie van de hersenen bij het bereiden van acute plakjes. Deze procedure is gemakkelijk te combineren met fluorescerende etikettering van een individueel celtype, zoals een bepaalde interneuron-subklasse. Om dit te doen, zouden we een transgeen dier gebruiken dat een recombinase in dat specifieke celtype tot expressie brengt.Viraal geleverde optogenetische constructen hebben snelle vooruitgang mogelijk gemaakt op het gebied van systemen en circuitneurowetenschappen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

Correleren Behavioral Reacties op fMRI-signalen van de Mens prefrontale cortex: Het onderzoeken van cognitieve processen met behulp van Task Analyse

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-geïnduceerde aanmaakhout muismodel

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Gecombineerde Transcraniële magnetische stimulatie en elektro-encefalografie van de Dorsolateral van de prefrontale Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...