Name: ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק Wellcome 206401/Z/17/Z. ברצוננו להודות לזפאר בשיר על חונכותו המקצועית ולד"ר קלייר בות' על הסיוע הטכני וההערות על כתב היד.

כל ההליכים לבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי חיים בבריטניה (1986) וההנחיות הקשורות אליו, כמו גם הנחיות מוסדיות מקומיות.
1. הזרקה ויראלית סטריאוטקסית
הערה: הפרוטוקול הנוכחי דורש ספציפיות אנטומית, אך לא פוסט-סינפטית.
<ol><li>בחר את החיה המת?...

<ol>
	<li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li><li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas.">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons.">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li><li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning.">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network.">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex.">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices.">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li><li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents.">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li><li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions.">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens/rhomboid+nuclei+and+hippocampus.">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers.">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li><li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat.">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li><li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex.">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception.">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li><li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes+1,+8,+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport.">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li><li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species.">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li><li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations.">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses.">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li><li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality.">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקור הקרנות סינפטיות ארוכות טווח ספציפיות ביותר באמצעות שילוב של ניתוחים סטריאוטקסיים כדי לספק AAVs המקודדים מבנים אופטוגנטיים, ואלקטרופיזיולוגיה בפרוסות מוח חריפות (איור 1). יחד טכניקות אלה מציעות כלים לאפיון הפיזיולוגיה והפלסטיות של מעגלי?...

הבנת הפיזיולוגיה של הסינפסות וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים היא בסיסית להבנת האופן שבו רשתות מוחיות מתפקדות במוח בריא1, וכיצד הן מתפקדות בהפרעות מוחיות. השימוש בפרוסות מוח חריפות של ex vivo מאפשר הקלטה של הפעילות החשמלית של סינפסות מנוירונים בודדים עם יחס אות לרעש גבוה באמצעות הקלטות של מהדק טלאי שלם. שליטה בפוטנציאל הממברנה ומניפולציה פרמקולוגית פשוטה מאפשרת בידוד של תת-סוגים של קולטנים. ניתן לבצע הקלטות אלה בספציפיות מעודנת כדי לזהות את הנוירון הפוסט-סינפטי, כולל מיקום למינרי ותת-אזורי2, מורפולוגיה תאית3, נוכחות של סמנים מולקולריים4, התחזיות האפקטיביות שלו5, או אפילו אם הוא היה פעיל לאחרונה6.
עם זאת, השגת ספציפיות של תשומות קדם-סינפטיות היא, עם זאת, קצת יותר מאתגרת. השיטה הקונבנציונלית השתמשה באלקטרודות גירוי כדי לעורר את האקסונים הפועלים בלמינה מסוימת. דוגמה לכך היא בהיפוקמפוס, שם גירוי מקומי בשכבה רדיאטום מפעיל סינפסות שמקרינות מ-CA3 לתת-השדה CA17. במקרה זה, הספציפיות הקדם-סינפטית מושגת כאשר קלט CA3 מייצג את הקלט המעורר היחיד הממוקם בתוך רדיאטום שכבה אשר מקרין לתאים פירמידליים CA18. רמה גבוהה זו של ספציפיות קלט הניתנת להשגה עם הפעלה קדם-סינפטית חשמלית קונבנציונלית של אקסונים CA3-CA1 היא, עם זאת, יוצא מן הכלל אשר בא לידי ביטוי במחקר אינטנסיבי כי סינפסה זו היה נתון. באזורים אחרים במוח, אקסונים ממסלולים רבים מתקיימים יחד באותה למינה, לדוגמה, בשכבה 1 של ניאוקורטקס9, ובכך הופכים גירוי קדם-סינפטי ספציפי לקלט לבלתי אפשרי עם אלקטרודות מגרה קונבנציונליות. זה בעייתי מכיוון שלקלטים סינפטיים שונים עשויות להיות תכונות פיזיולוגיות שונות; לכן, הגירוי המשותף שלהם עלול להוביל לאפיון שגוי של הפיזיולוגיה הסינפטית.
הופעתה של האופטוגנטיקה, הקידוד הגנטי של חלבוני ממברנה רגישים לאור (אופסינים) כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), אפשרה הרחבה עצומה של אפשרויות לחקר תחזיות סינפטיות מבודדות בין אזורי מוח10,11. כאן אנו מתארים פתרון הניתן להכללה ובעלות נמוכה לחקר פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות. המבנים האופטוגנטיים מועברים באופן ספציפי מאוד באמצעות וקטורים נגיפיים המאפשרים שליטה מדויקת ביותר באזור העניין הקדם-סינפטי. הקרנות אפרנט יבטאו את הערוץ המופעל על ידי האור ויאפשרו הפעלה של סיבים אלה באזור מטרה. לפיכך, ניתן לחקור מסלולים ארוכי טווח, מפוזרים אנטומית, שלא ניתן להפעילם באופן עצמאי על ידי גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי.
אנו מתארים, כמסלול לדוגמה, התמרה של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) עם וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) המקודדים אופסינים של תעלת קטיון מעוררת. לאחר מכן אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חריפות מקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC), הקלטות של מהדקי טלאי מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של תחזיות mPFC-LEC גלוטמטרגיות (איור 1). אנו מתארים גם את ההערכה ההיסטולוגית של אתר ההזרקה כדי לאשר את המיקום של האזור הקדם-סינפטי של עניין וזיהוי של מורפולוגיה של תאים פוסט-סינפטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tube</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>12134102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way luer valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30600-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine (DAB) substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PLN4X/0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35512</td>
			<td>Viral titre: 3.3x1013 GC/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>49363</td>
			<td>Focusses visual spectrum and near-IR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005*</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera - Qimaging Retiga Electro</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>01-ELECTRO-M-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbachol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetasept</td>
			<td>XHG008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Andis</td>
			<td>22445</td>
			<td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimation condenser lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ACL2520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10011913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Rapid Electronics Ltd</td>
			<td>84-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6341 BNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 500 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 600 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with side port</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>895150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET570/20x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paint brush</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BRU2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>30% (w/w)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic fluorescence filter cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DFM1T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine ointment</td>
			<td>Teva</td>
			<td>80007150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted blue LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted green LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M565L3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaGTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR LED</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>SFH4550</td>
			<td>Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RAYLLAMB/OCT</td>
			<td>Optimal cutting temperature medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Ministar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>23-769-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-26-GH/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder for micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>OPMI 1 FR pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter for intracellular recording solution</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin citrate</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10458842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinLTP</td>
			<td>https://www.winltp.com/</td>
			<td>Version 2.32</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular?</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex

חקר התכונות הפיזיולוגיות של סינפסות מסוימות במוח, וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים, הוא אתגר מרכזי במדעי המוח המודרניים. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות במבחנה משתמשות בגירוי חשמלי כדי לעורר תמסורת סינפטית. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא האופי הלא ספציפי שלה; כל האקסונים באזור האלקטרודה המגרה יופעלו, מה שמקשה על ייחוס אפקט לחיבור אפרנטי מסוים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי החלפת גירוי חשמלי בגירוי מבוסס אופטוגנטיקה. אנו מתארים שיטה לשילוב אופטוגנטיקה עם הקלטות מהדקי טלאים במבחנה . זהו כלי רב עוצמה לחקר ההעברה הסינפטית הבסיסית והפלסטיות הסינפטית של קשרים סינפטיים מדויקים המוגדרים אנטומית, והוא ישים כמעט לכל מסלול במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והטיפול בווקטור נגיפי המקודד חלבון channelrhodopsin להזרקה כירורגית לאזור טרום-סינפטי בעל עניין (קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית) במוח המכרסם ויצירת פרוסות חריפות של אזורי מטרה במורד הזרם (קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית). כמו כן מוצג הליך מפורט לשילוב הקלטות מהדקי טלאים עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית לטווח קצר וארוך. אנו דנים בדוגמאות לניסויים שמשיגים ספציפיות של מסלולים ותאים על ידי שילוב של אופטוגנטיקה ותיוג תאים תלויי Cre. לבסוף, אישור היסטולוגי של האזור הקדם-סינפטי של העניין מתואר יחד עם תיוג ביוציטין של התא הפוסט-סינפטי, כדי לאפשר זיהוי נוסף של המיקום המדויק וסוג התא.

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לחקור פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות באמצעות העברה נגיפית של מבנים אופטוגנטיים. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות רבה לחקר כמעט כל קשר ארוך טווח במוח. לדוגמה, אנו מתארים את ההזרקה של AAVs המקודדים אופסין לתוך mPFC של חולדה, הכנת פרוסות חריפות מ-LEC, הקלטות של מה...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי מאפשרים אפיון אלקטרופיזיולוגי מפורט של הפיזיולוגיה והפלסטיות של סינפסות ספציפיות בפרוסות מוח חריפות. היתרונות העיקריים של הפעלת סינפסות באופן אופטיגנטי הם היכולת לחקור מסלולים ארוכי טווח, והגירוי הסלקטיבי של אקסונים שאינם מופרדים אנטומית. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר ליסה קינאוונה, עמיתת מחקר מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל, טען מזרק המילטון לתוך משאבת מזרק מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע ניידת המורכבת על מסגרת סטריאוטקסית. לאחר מכן מניחים אליקוט של חמישה מיקרוליטרים של הנגיף במיקרוצנטריפוגה. סובבו את הצינור למשך מספר שניות והכניסו שני מיקרוליטרים של ההכנה הנגיפית לתוך מכסה הצינור.כדי למלא את המזרק בהכנה הנגיפית, צפו בקצה המחט במיקרוסקופ כירורגי. לאחר מכן מניחים ידנית את הבולוס של הנגיף בקצה המחט, ומושכים את בוכנה המזרק באמצעות פקדי המשאבה. הגדר את נפח הזרקת המשאבה ל-300 ננוליטר ואת קצב הזרימה ל-100 ננוליטר לדקה.הפעל את המשאבה ואשר זרימה תקינה על ידי התבוננות בטיפת הנגיף בקצה המחט. סופגים את הנגיף על צמר גפן, ומנקים את המחט עם 70% אתנול. לאחר מכן, באמצעות ברגי הכוונון על המסגרת הסטריאוטקסית, נווט את קצה המחט אל הברגמה, ושים לב למדידות הסטריאוטקסיות שנצפו בשלושת סולמות ורנייה במסגרת.להוסיף, או להחסיר מרחקים אלה מקואורדינטות bregma. צור חור בור במשטח הגולגולת באמצעות מקדחה זעירה המורכבת על הזרוע הסטריאוטקסית. מחדירים את המחט למוח בקואורדינטות הגבי שנקבעו מראש, ומחדירים נפח קבוע מראש של ההכנה הנגיפית.לאחר עירוי, השאירו את המחט באתרה למשך 10 דקות כדי לאפשר את פיזור הבולוס. לאחר מכן הסר את המחט, והפעל את המשאבה כדי להבטיח שהמחט אינה חסומה. שבועיים לאחר ההזרקה הנגיפית, מרדימים את החולדה, מנתחים במהירות את כל המוח ומעבירים אותו לתמיסת חיתוך סוכרוז.בעזרת כפית מתכת, הרימו את המוח, השליכו את התמיסה העודפת והניחו אותה על נייר סינון. באמצעות אזמל, להסיר את המוח הקטן, ולחתוך את המוח במישור קורונל בערך באמצע הדרך לאורכו. החצי האחורי הוא גוש הרקמה LEC.החזירו את גוש הרקמה ואת המוח הנותר לתמיסת חיתוך סוכרוז. לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק ציאנואקרילט על שלב הוויברטום, ופזרו אותו לשכבה דקה. לאחר מכן באמצעות כפית, בחר את בלוק הרקמה של LEC, והעבר אותו על מדבקת הדבק, כך שהחתך הקורונלי הקדמי נדבק.התקן את הבמה לתוך תא רקמת ויברטום, ושפכו במהירות תמיסת חיתוך סוכרוז מספקת כדי להטביע את הרקמה. לאחר כיוון פני השטח הגחוניים של גוש הרקמה לכיוון הלהב, חותכים פרוסות בעובי 350 מיקרומטר מגחון לגב באמצעות מהירות התקדמות להב איטית. בדרך כלל, ניתן להשיג שבע פרוסות לכל חצי כדור.מעבירים את הפרוסות לתא איסוף הפרוסות. לאחר מכן הניחו את תא האיסוף באמבט מים של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני שתחזרו לטמפרטורת החדר. מניחים את שארית המוח בפרפורמלדהיד למשך 48 שעות.לזיהוי תאי יעד, מקמו את הפרוסה בתא ההקלטה, ושתקו אותה באמצעות עוגן פרוסה. תחת הגדלה נמוכה, באמצעות תאורת אינפרא אדום, נווט לשכבת LEC חמש. לאחר מכן עברו למטרת טבילת המים בהגדלה גבוהה, וזהו את הנוירונים הפירמידליים.סמן את המיקום של התא על הצג עם קלטת. לאחר מכן, כדי ליצור מהדק טלאי תא שלם, לייצר מיקרו-פיפטה זכוכית בורוסיליקט, ולמלא אותו עם פתרון הקלטה תוך תאית. הניחו את המיקרו-פיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה והפעילו לחץ חיובי על ידי נשיפה חזקה לתוך פיה המחוברת ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה.הרימו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראותה במיקרוסקופ. פתח את החלון בדיקת חותם וקבע אם עמידות הפיפטה היא שלושה עד חמישה מגה-אוהם. לאחר מכן גע בתא המזוהה עם קצה פיפטה, וכתוצאה מכך כניסה בקרום התא.לאחר מכן, להחיל לחץ שלילי על ידי יניקה על השופר, הגדלת התנגדות פיפטה. המשיכו להפעיל לחץ שלילי בהדרגה עד שקרום התא נקרע, וכתוצאה מכך קיבול התא כולו חולף. כדי להיכנס לתצורת המהדק הנוכחית, השתמש בנורית LED מותקנת המכוונת לנתיב האור של המיקרוסקופ עם קוביות סינון ואופטיקה מתאימה, והחל פולסים של אור על הפרוסה דרך המטרה 40X.ספק רכבות של פולסים קלים מרובים ב-5 הרץ, 10 הרץ ו-20 הרץ כדי לחקור את תכונות השחרור הקדם-סינפטי. כדי לאפשר לביוציטין למלא את הנוירון, יש להמתין לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, עקוב אחר קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה.לאחר מכן משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמות האיטית של טרנזיינטים קיבוליים וזרם ממברנה, מה שמעיד על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות של טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. מניחים את הפרוסה בפרפורמלדהיד בצלחת של 24 בארות ודוגרים למשך הלילה. באמצעות מדיום OCT, הצמידו גוש רקמה לדיסק הדגימה של קריוסטאט.כדי להקפיא את הרקמה, מניחים איזופנטן במיכל מתאים ומטביעים את דיסק הדגימה, כדי להבטיח שהרקמה תהיה מעל רמת האיזופנטאן. לאחר מכן להוריד את המיכל של isopentane לתוך חנקן נוזלי, ולאפשר לרקמה להקפיא. לאחר שהרקמה קפואה לחלוטין, השאירו את בלוק הרקמה בתא הקריוסטאט במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לטמפרטורת הבלוק להתאזן.לאחר שיווי משקל, חותכים חתכים חתכים בעובי 40 מיקרומטר בקריוסטט, ומשתמשים במכחול עדין כדי להנחות את החלקים מהלהב. הדבק את החלקים הקפואים האלה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית מצופה פולי-L-ליזין בטמפרטורת החדר על ידי נגיעה בשקופית לחלקים. לאחר הוספת 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לכל שקופית, יש למרוח את הכיסוי ולהסיר את בועות האוויר על ידי לחיצה עדינה על החלקת הכיסוי.כסו את השקופיות כדי להגן מפני הלבנת תמונות, ותנו להן להתייבש באוויר במשך 12 שעות. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבחון את המיקום של אתר ההזרקה הנגיפית. לצביעת ביוציטין, דגרו את הפרוסות ב-3% מי חמצן ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כל פעילות אנדוגנית של פרוקסידאז.לאחר מכן שטפו את פרוסות המוח עם PBS עד שלא נראות בועות חמצן נוספות. לאחר מכן, דגרו את הפרוסות במשך שלוש שעות בתמיסת קומפלקס HRP 1%avidin-biotinylated ב-PBS המכילה 0.1% Triton X-100. לאחר שש שטיפות PBS, דגרו כל פרוסה בתמיסת DAB עד שהכתם הביוציטין של מבנים עצביים הופך גלוי.עצור את התגובה על ידי העברת הפרוסות ב- PBS קר. לאחר מכן הרכיבו את הפרוסות על מגלשות מיקרוסקופ הזכוכית באמצעות מברשת. לאחר הסרת PBS עודף, הוסף מדיום הרכבה.מכסים את הפרוסות באמצעות תלושי כיסוי, ומניחים להן להתייבש באוויר, כפי שהודגם קודם לכן. תא פירמידלי בריא אותר ותוקן. אם נדרש זיהוי תאים פוסט-סינפטיים, יש למקם תא המבטא את הסמן הפלואורסצנטי באמצעות אופטיקה של שדה רחב.פולסים של אור יחיד של שתי אלפיות השנייה גרמו לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים פשוטים בצורת גל. פלסטיות לטווח קצר של הסינפסה נבחנת על ידי הפעלת 5, 10 ו -20 הרץ רכבות של גירוי קל. תוך כדי חקירת פלסטיות ארוכת טווח, הוספת קרבכול אגוניסט כולינרגי ל-aCSF במחזור במשך 10 דקות גרמה לדיכאון ארוך טווח שעדיין ניכר 40 דקות לאחר הסרת הליגנד.אורך אתר ההזרקה נבדק באופן היסטולוגי. הכתב הפלואורסצנטי mCherry היה מקומי לשכבות העמוקות יותר של קליפת המוח הפרה-לימבית והאינפרה-לימבית. יתר על כן, צביעת תא מלא בביוציטין אישרה את מיקומו ואת המורפולוגיה שלו.השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם התמרה מדויקת של אזור המוח afferent, אשר ניתן לאמת לאחר הוק, ודיסקציה מהירה של המוח בעת הכנת פרוסות חריפות. הליך זה משולב בקלות עם תיוג פלואורסצנטי של סוג תא בודד, כגון תת-מחלקה מסוימת של interneuron. כדי לעשות זאת, נשתמש בחיה מהונדסת שמבטאת רקומבינאז בסוג התא המסוים הזה.מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי אפשרו התקדמות מהירה בתחומי המערכות ומדעי המוח המעגליים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

התאמת תגובות התנהגותיות לאותות-fMRI של קליפת המוח הקדם חזיתית האנושי: בחינת תהליכים קוגניטיביים באמצעות ניתוח משימה

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

גירוי מגנטי טראנס המשולבת ואת אלקטרואנצפלוגרם של קליפת המוח הקדם חזיתית דורסולטרלי

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...