Name: ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

이 작업은 Wellcome 보조금 206401/Z/17/Z의 지원을 받습니다. 전문가 멘토링을 해주신 Zafar Bashir 님과 원고에 대한 기술 지원 및 의견을 주신 Clair Booth 박사에게 감사드립니다.

모든 동물 절차는 영국 동물 과학 절차법 (1986) 및 관련 지침 및 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 정위 바이러스 주사
참고: 현재 프로토콜은 해부학적이지만 시냅스 후 세포 유형, 특이성은 필요하지 않습니다.
<ol><li>적절한 동물을 선택하십시오. 수컷 야생형 리스터 후드 래트를 이 프로토콜에 사용하였다(300-350 g, 대략 3개월령).</l...

<ol>
	<li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li><li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas.">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons.">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li><li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning.">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network.">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex.">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices.">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li><li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents.">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li><li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions.">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens/rhomboid+nuclei+and+hippocampus.">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers.">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li><li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat.">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li><li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex.">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception.">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li><li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes+1,+8,+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport.">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li><li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species.">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li><li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations.">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses.">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li><li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality.">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 광유전학적 구조를 암호화하는 AAV를 전달하기 위한 정위 수술과 급성 뇌 절편에서 전기생리학의 조합을 사용하여 고도로 특이적인 장거리 시냅스 투영을 탐색하는 방법을 설명합니다(그림 1). 이러한 기술은 함께 기존의 비특이적 전기 자극을 사용하여 이전에는 접근 할 수 없었던 장거리 및 해부학 적으로 확산 된 경로에서 높은 정밀도로 뇌 회?...

시냅스의 생리학과 시냅스가 어떻게 소성 변화를 겪는지를 이해하는 것은 건강한 뇌에서 뇌 네트워크가 어떻게 기능하는지1,그리고 뇌 장애에서 어떻게 오작동하는지 이해하는 데 필수적입니다. 급성 생체 외 뇌 슬라이스를 사용하면 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하여 신호 대 잡음비가 높은 단일 뉴런에서 시냅스의 전기적 활동을 기록 할 수 있습니다. 막 전위의 제어와 간단한 약리학 적 조작은 수용체 아형의 분리를 가능하게합니다. 이러한 기록은 층류 및 하위 영역위치 2, 세포 형태3, 분자 마커의 존재4, 구 심성 투영5, 또는 최근에 활성화 된 경우에도6을 포함하는 시냅스 후 뉴런을 식별하기 위해 절묘한 특이성으로 이루어질 수 있습니다.
그러나 시냅스 전 입력의 특이성을 달성하는 것은 다소 어렵습니다. 종래의 방법은 특정 층에서 실행되는 축삭을 흥분시키기 위해 자극 전극을 사용했습니다. 이것의 예는 지층 반경의 국소 자극이 CA3에서 CA1 하위 필드7로 투사하는 시냅스를 활성화시키는 해마입니다. 이 경우, 시냅스 전 특이성은 CA3 입력이 CA1 피라미드 세포8에 투영되는 지층 반경 내에 위치한 유일한 흥분성 입력을 나타내기 때문에 달성됩니다. 그러나 CA3-CA1 축삭의 종래의 전기적 시냅스 전 활성화로 달성 할 수있는이 높은 수준의 입력 특이성은이 시냅스가 겪은 강렬한 연구에 반영된 예외입니다. 다른 뇌 영역에서는 여러 구 심성 경로의 축삭이 동일한 층, 예를 들어 신피질9의 층 1에 공존하므로 기존의 자극 전극으로는 입력 특이 적 시냅스 전 자극이 불가능합니다. 이것은 다른 시냅스 입력이 다양한 생리적 특성을 가질 수 있기 때문에 문제가 됩니다. 따라서, 이들의 공동 자극은 시냅스 생리학의 잘못된 특성화로 이어질 수 있습니다.
channelrhodopsin-2 (ChR2)와 같은 감광성 막 단백질 (opsins)의 유전 적 암호화 인 광유전학의 출현은 뇌 영역10,11 사이의 고립 된 시냅스 투영을 연구 할 수있는 가능성을 크게 확장 할 수있게했습니다. 여기에서는 장거리 시냅스 생리학 및 가소성을 연구하기위한 일반화 가능하고 저렴한 솔루션을 설명합니다. 광유전학적 구축물은 바이러스 벡터를 사용하여 매우 특이적인 방식으로 전달되어 관심 전 시냅스 영역을 매우 정밀하게 제어할 수 있습니다. 원심성 돌기는 표적 영역에서 이들 섬유의 활성화를 허용하는 광 활성화 채널을 표현할 것이다. 따라서, 전통적, 비특이적, 전기 자극에 의해 독립적으로 활성화 될 수없는 장거리, 해부학 적으로 확산 된 경로가 연구 될 수있다.
우리는 흥분성 양이온 채널 옵신을 암호화하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용한 내측 전두엽 피질 (mPFC)의 형질 도입을 예로 들어 설명합니다. 그런 다음 측면 내 후각 피질 (LEC)의 급성 절편 준비, 5 층 LEC 피라미드 뉴런의 패치 클램프 기록 및 글루탐산 성 mPFC-LEC 투영의 광 유발 활성화에 대해 설명합니다 (그림 1). 우리는 또한 관심 있는 시냅스 전 영역의 위치를 확인하고 시냅스 후 세포 형태를 식별하기 위해 주사 부위의 조직학적 평가를 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tube</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>12134102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way luer valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30600-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine (DAB) substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PLN4X/0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35512</td>
			<td>Viral titre: 3.3x1013 GC/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>49363</td>
			<td>Focusses visual spectrum and near-IR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005*</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera - Qimaging Retiga Electro</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>01-ELECTRO-M-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbachol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetasept</td>
			<td>XHG008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Andis</td>
			<td>22445</td>
			<td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimation condenser lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ACL2520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10011913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Rapid Electronics Ltd</td>
			<td>84-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6341 BNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 500 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 600 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with side port</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>895150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET570/20x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paint brush</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BRU2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>30% (w/w)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic fluorescence filter cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DFM1T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine ointment</td>
			<td>Teva</td>
			<td>80007150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted blue LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted green LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M565L3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaGTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR LED</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>SFH4550</td>
			<td>Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RAYLLAMB/OCT</td>
			<td>Optimal cutting temperature medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Ministar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>23-769-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-26-GH/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder for micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>OPMI 1 FR pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter for intracellular recording solution</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin citrate</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10458842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinLTP</td>
			<td>https://www.winltp.com/</td>
			<td>Version 2.32</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular?</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex

뇌의 특정 시냅스의 생리적 특성과 소성 변화를 겪는 방법을 연구하는 것은 현대 신경 과학의 핵심 과제입니다. 전통적인 체외 전기 생리 학적 기술은 전기 자극을 사용하여 시냅스 전달을 불러 일으 킵니다. 이 방법의 주요 단점은 비특이적 특성입니다. 자극 전극 영역의 모든 축삭이 활성화되어 특정 구 심성 연결에 영향을 미치기가 어렵습니다. 이 문제는 전기 자극을 광유전학 기반 자극으로 대체함으로써 극복할 수 있습니다. 우리는 광유전학을 시험관 내 패치 클램프 기록과 결합하는 방법을 설명합니다. 이것은 정확한 해부학 적으로 정의 된 시냅스 연결의 기저 시냅스 전달과 시냅스 가소성 모두를 연구하기위한 강력한 도구이며 뇌의 거의 모든 경로에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 설치류 뇌의 시냅스 전 관심 영역(내측 전전두엽 피질)에 외과적 주사를 위한 채널로돕신 단백질을 코딩하는 바이러스 벡터의 준비 및 처리와 하류 표적 영역(측면 entorhinal cortex)의 급성 절편을 만드는 방법에 대해 설명합니다. 장단기 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 기록과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합하는 자세한 절차도 제시됩니다. 우리는 광유전학과 Cre 의존성 세포 표지를 결합하여 경로 및 세포 특이성을 달성하는 실험의 예를 논의합니다. 마지막으로, 관심 전 시냅스 영역의 조직학적 확인은 시냅스 후 세포의 바이오사이틴 표지와 함께 설명되어, 정확한 위치 및 세포 유형의 추가 식별을 가능하게 한다.

이 프로토콜에서는 광유전학적 구조물의 바이러스 전달을 사용하여 장거리 시냅스 생리학 및 가소성을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌의 거의 모든 장거리 연결을 연구하는 데 매우 쉽게 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 옵신을 암호화하는 AAV를 쥐 mPFC에 주입하고, LEC에서 급성 절편을 준비하고, 레이어 5 LEC 피라미드 뉴런에서 패치 클램프 기록하고, LEC에서 mPFC 말단의 광 유발 활...

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Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

바이러스로 전달되는 광유전학적 구조는 급성 뇌 절편에서 특정 시냅스의 생리학 및 가소성에 대한 상세한 전기생리학적 특성을 허용합니다. 시냅스를 광유전학적으로 활성화하는 주요 이점은 장거리 경로를 연구할 수 있는 능력과 해부학적으로 분리되지 않은 축삭의 선택적 자극입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구원 인 Lisa Kinnavane 박사가 될 것입니다.시작하려면 해밀턴 주사기를 정위 프레임에 장착 된 이동식 암에 부착 된 미세 주입 주사기 펌프에로드합니다. 그런 다음 바이러스의 5 마이크로 리터 부분 표본을 마이크로 원심 분리기에 넣으십시오. 튜브를 몇 초 동안 돌리고 2 마이크로 리터의 바이러스 제제를 튜브 뚜껑에 피펫팅합니다.주사기에 바이러스 제제를 채우려면 수술 용 현미경으로 바늘 끝을보십시오. 그런 다음 바늘 끝에 바이러스의 볼 루스를 수동으로 놓고 펌프 컨트롤을 사용하여 주사기 플런저를 빼냅니다. 펌프 주입량을 300나노리터로 설정하고 유량을 분당 100나노리터로 설정합니다.펌프를 가동하고 바늘 끝에서 바이러스 방울을 관찰하여 적절한 흐름을 확인하십시오. 면봉에 바이러스를 흡수하고 70 % 에탄올로 바늘을 청소하십시오. 다음으로, 정위 프레임의 조절기 나사를 사용하여 바늘 끝을 브레그마로 탐색하고 프레임의 세 버니어 스케일에서 관찰된 정위 측정값을 기록해 둡니다.브레그마 좌표에서 이러한 거리를 더하거나 뺍니다. 정위 팔에 장착 된 마이크로 드릴을 사용하여 두개골 표면에 버 구멍을 만드십시오. 바늘을 소정의 배측 배위에서 뇌 내로 삽입하고, 소정의 부피의 바이러스 제제를 주입한다.주입 후, 볼 루스의 확산을 허용하기 위해 바늘을 10 분 동안 제자리에 두십시오. 그런 다음 바늘을 제거하고 펌프를 작동시켜 바늘이 막히지 않도록하십시오. 바이러스 주사 2 주 후, 쥐를 안락사시키고, 전체 뇌를 신속하게 해부하고, 자당 절단 용액으로 옮깁니다.금속 티스푼을 사용하여 뇌를 집어 들고 여분의 용액을 버리고 여과지 위에 놓습니다. 메스를 사용하여 소뇌를 제거하고 대뇌를 길이를 따라 약 절반 정도 관상 동맥에서 자릅니다. 뒤쪽 절반은 LEC 조직 블록입니다.조직 블록과 나머지 뇌를 자당 절단 용액으로 되돌립니다. 다음으로, 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 비브라톰 스테이지에 놓고 얇은 층으로 펴 바릅니다. 그런 다음 티스푼을 사용하여 LEC 조직 블록을 선택하고 전방 관상 절단이 부착되도록 접착제 패치에 옮깁니다.스테이지를 비브라톰 조직 챔버에 설치하고 조직을 잠수하기에 충분한 자당 절단 용액을 빠르게 붓습니다. 조직 블록의 복부 표면을 칼날쪽으로 향하게 한 후 느린 칼날 전진 속도를 사용하여 복부에서 등쪽까지 350 마이크로 미터 두께의 조각을 자릅니다. 일반적으로 반구 당 7 개의 슬라이스를 얻을 수 있습니다.슬라이스를 슬라이스 수집 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 수집 챔버를 섭씨 34도의 수조에 1시간 동안 두었다가 실온으로 돌아갑니다. 뇌의 나머지 부분을 파라 포름 알데히드에 48 시간 동안 두십시오.표적 세포 식별을 위해 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 슬라이스 앵커를 사용하여 고정합니다. 저배율에서 적외선 조명을 사용하여 LEC 레이어 5로 이동합니다. 그런 다음 고배율 수침 대물렌즈로 변경하고 피라미드 뉴런을 식별합니다.테이프로 모니터의 셀 위치를 표시하십시오. 다음으로, 전체 세포 패치 클램프를 형성하기 위해, 붕규산 유리 마이크로 피펫을 제작하고, 이를 세포내 기록 용액으로 채운다. 채워진 마이크로 피펫을 전극 홀더에 놓고 전극 홀더 측면 포트에 연결된 마우스피스에 세게 불어 양압을 가합니다.반월판이 형성되도록 현미경 대물렌즈를 올리고 현미경에서 볼 수 있을 때까지 전극을 반월판에 삽입합니다. 씰 테스트 창을 열고 피펫 저항이 3-5메가옴인지 확인합니다. 그런 다음 확인 된 세포를 피펫 팁으로 만지면 세포막에 움푹 들어간 곳이 생깁니다.다음으로, 마우스 피스에서 흡입하여 음압을 가하여 피펫 저항을 증가시킵니다. 세포막이 파열 될 때까지 점차적으로 음압을 계속 가하여 전체 세포 커패시턴스 과도 상태가 발생합니다. 전류 클램프 구성을 시작하려면 필터 큐브와 적절한 광학 장치가 있는 현미경 광 경로로 향하는 장착된 LED를 사용하고 40X 대물렌즈를 통해 슬라이스에 광 펄스를 적용합니다.5 헤르츠, 10 헤르츠 및 20 헤르츠에서 여러 광 펄스의 트레인을 전달하여 시냅스 전 방출 특성을 조사합니다. 바이오 사이클틴이 뉴런을 채울 수 있도록하려면 전체 세포 구성에 들어간 후 최소 15 분 동안 기다리십시오. 전압 클램프에서 멤브레인 커패시턴스와 입력 저항을 모니터링합니다.그런 다음 세포의 체세포에서 접근 각도를 따라 피펫을 천천히 빼내어 정전 용량 과도 상태 및 막 전류가 천천히 사라지는 것을 관찰하여 세포막의 재밀봉 및 피펫 팁에 아웃사이드 아웃 패치의 형성을 나타냅니다. 슬라이스를 24웰 플레이트의 파라포름알데히드에 넣고 밤새 배양합니다. OCT 배지를 사용하여 조직 블록을 저온 유지 표본 디스크에 부착합니다.조직을 동결하려면 이소펜탄을 적절한 용기에 넣고 표본 디스크를 담그고 조직이 이소펜탄 수준보다 높도록 합니다. 그런 다음 이소 펜탄 용기를 액체 질소로 내리고 조직이 얼도록하십시오. 조직이 완전히 얼면 조직 블록을 저온 유지 장치 챔버에 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 그대로 두어 블록의 온도가 평형을 이루도록 합니다.평형 후 저온 유지 장치에서 40마이크로미터 두께의 섹션을 자르고 가는 붓을 사용하여 블레이드에서 섹션을 안내합니다. 이러한 동결 절편을 실온 폴리-L-라이신-코팅된 유리 현미경 슬라이드에 부착하여 상기 슬라이드를 절편에 접촉시킨다. 각 슬라이드에 150마이크로리터의 장착 매체를 추가한 후 커버 슬립을 적용하고 커버 슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.광퇴색으로부터 보호하기 위해 슬라이드를 덮고 12시간 동안 자연 건조시키십시오. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 바이러스 주사 부위의 위치를 검사합니다. 바이오 사이 틴 염색을 위해 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해 PBS의 3 % 과산화수소에 30 분 동안 슬라이스를 배양하십시오.그런 다음 더 이상 산소 거품이 보이지 않을 때까지 PBS로 뇌 조각을 씻으십시오. 다음으로, 슬라이스를 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 1%아비딘-비오티닐화된 HRP 복합체 용액에서 3시간 동안 배양한다. 6 개의 PBS 세척 후, 신경 구조의 바이오 사이틴 염색이 보일 때까지 DAB 용액에서 각 슬라이스를 배양합니다.차가운 PBS에서 슬라이스를 옮겨 반응을 중지시킨다. 그런 다음 브러시를 사용하여 슬라이스를 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다. 과도한 PBS를 제거한 후 장착 매체를 추가하십시오.커버 슬립을 사용하여 슬라이스를 덮고 앞에서 설명한 대로 자연 건조시킵니다. 건강한 피라미드 세포를 찾아 패치했습니다. 시냅스 후 세포 식별이 필요한 경우 형광 마커를 발현하는 세포를 광시야 광학을 사용하여 국소화해야 합니다.2 밀리 초의 단일 광 펄스는 단순한 파형 광유전 흥분성 시냅스 후 전위를 초래했습니다. 시냅스의 단기 가소성은 5, 10 및 20 헤르츠 트레인의 광 자극을 적용하여 검사합니다. 장기 가소성을 조사하는 동안 콜린성 작용제 카르바콜을 순환 aCSF에 10분 동안 첨가하면 리간드 제거 후 40분 후에도 여전히 명백한 장기 우울증이 발생했습니다.주사 부위의 길이를 조직학적으로 검사하였다. 형광 리포터 mCherry는 전위 및 하부 변연계 피질의 더 깊은 층에 국한되었습니다. 또한, 바이오 사이클틴으로 채워진 세포를 염색하여 그 위치와 형태를 확인했다.이 프로토콜의 중요한 단계는 사후에 확인할 수있는 구 심성 뇌 영역의 정확한 형질과 급성 절편을 준비 할 때 뇌의 신속한 해부입니다. 이 절차는 특정 인터뉴런 서브클래스와 같은 개별 세포 유형의 형광 표지와 용이하게 조합된다. 이를 위해 우리는 특정 세포 유형에서 재조합 효소를 발현하는 형질 전환 동물을 사용합니다.바이러스로 전달되는 광유전학적 구조는 시스템 및 회로 신경과학 분야에서 급속한 발전을 가능하게 했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

인간의 전두엽 피질에서 fMRI 신호에 행동 응답을 연관 : 작업 분석을 사용하여인지 과정을 검토

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

연구

신경과학

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole 유도 점화 마우스 모델

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...