Name: ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Bu çalışma Wellcome hibe 206401/Z/17/Z tarafından desteklenmektedir. Zafar Beşir'e uzman mentorluğu için ve Dr. Clair Booth'a teknik yardım ve makale hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan prosedürleri, Birleşik Krallık Hayvanlar Bilimsel Prosedürler Yasası (1986) ve ilgili kılavuzların yanı sıra yerel kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Stereotaksik viral enjeksiyon
NOT: Mevcut protokol anatomik gerektirir, ancak sinaptik hücre sonrası hücre tipi değil, özgüllük gerektirir.
<ol><li>Uygun hayvanı seçin. Bu protokolde erkek vahşi tip Lister kapüşonlu sıçanlar kullanıldı (300...

<ol>
	<li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li><li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas.">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons.">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li><li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning.">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network.">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex.">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices.">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li><li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents.">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li><li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions.">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens/rhomboid+nuclei+and+hippocampus.">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers.">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li><li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat.">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li><li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex.">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception.">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li><li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes+1,+8,+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport.">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li><li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species.">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li><li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations.">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).</li><li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP.">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses.">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li><li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality.">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li></ol>

Burada sunulan protokol, optogenetik yapıları kodlayan AAV'leri ve akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojiyi sunmak için stereotaksik cerrahinin bir kombinasyonunu kullanarak oldukça spesifik uzun menzilli sinaptik projeksiyonları keşfetmek için bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Bu teknikler birlikte, daha önce geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon kullanılarak erişilemeyen uzun menzilli ve anatomik olarak dağınık yollarda beyin devresinin fizyolojisin...

Sinapsların fizyolojisini ve plastik değişikliklere nasıl uğradıklarını anlamak, beyin ağlarının sağlıklı beyinde nasıl çalıştığını anlamak için esastır1 ve beyin bozukluklarında nasıl arızalandıklarını anlamak için temeldir. Akut ex vivo beyin dilimlerinin kullanılması, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları kullanılarak tek nöronlardan sinapsların elektriksel aktivitesinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla kaydedilmesini sağlar. Membran potansiyelinin kontrolü ve basit farmakolojik manipülasyon, reseptör alt tiplerinin izolasyonuna izin verir. Bu kayıtlar, laminer ve alt bölgesel pozisyon2, hücresel morfoloji3, moleküler belirteçlerin varlığı4, afferent projeksiyonları5 veya yakın zamanda aktif olsa bile6 dahil olmak üzere post-sinaptik nöronu tanımlamak için mükemmel bir özgüllükle yapılabilir.
Bununla birlikte, sinaptik öncesi girdilerin özgüllüğünü elde etmek biraz daha zordur. Geleneksel yöntem, belirli bir laminada çalışan aksonları uyarmak için stimülasyon elektrotları kullanmıştır. Bunun bir örneği, stratum radiatumdaki lokal stimülasyonun, CA3'ten CA1 alt alanı7'ye yansıyan sinapsları aktive ettiği hipokampustadır. Bu örnekte, CA3 girişi, CA1 piramidal hücrelere8 yansıyan stratum radyatumunda bulunan tek uyarıcı girişi temsil ettiği için presinaptik özgüllük elde edilir. Bununla birlikte, CA3-CA1 eksenlerinin geleneksel elektriksel presinaptik aktivasyonu ile elde edilebilen bu yüksek giriş özgüllüğü derecesi, bu sinapsın maruz kaldığı yoğun çalışmaya yansıyan bir istisnadır. Diğer beyin bölgelerinde, çoklu afferent yollardan gelen aksonlar aynı laminada, örneğin neokorteks9'un 1. tabakasında bir arada bulunur, böylece geleneksel uyarıcı elektrotlarla girişe özgü presinaptik stimülasyonu imkansız hale getirir. Farklı sinaptik girdiler farklı fizyolojik özelliklere sahip olabileceğinden bu sorunludur; bu nedenle, birlikte stimülasyonları sinaptik fizyolojinin yanlış karakterize edilmesine yol açabilir.
Optogenetiğin ortaya çıkışı, channelrhodopsin-2 (ChR2) gibi ışığa duyarlı membran proteinlerinin (opsinler) genetik kodlaması, beyin bölgeleri10,11 arasındaki izole sinaptik projeksiyonları incelemek için olasılıkların geniş bir genişlemesine izin vermiştir. Burada, uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisiteyi incelemek için genelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir çözümü açıklıyoruz. Optogenetik yapılar, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin son derece hassas kontrolüne izin veren viral vektörler kullanılarak oldukça spesifik bir şekilde teslim edilir. Efferent projeksiyonları, bu liflerin bir hedef bölgede aktivasyonuna izin veren ışıkla aktive edilen kanalı ifade edecektir. Böylece, geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon ile bağımsız olarak aktive edilemeyen uzun menzilli, anatomik olarak dağınık yollar incelenebilir.
Örnek bir yol olarak, medial prefrontal korteksin (mPFC) uyarıcı katyon kanallı opsinleri kodlayan adeno ilişkili virüslerle (AAV'ler) transdüksiyonunu tanımladık. Daha sonra lateral entorinal korteksten (LEC) akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve glutamaterjik mPFC-LEC projeksiyonlarının ışıkla uyarılmış aktivasyonunu tanımladık (Şekil 1). Ayrıca, pre-sinaptik bölgenin yerini doğrulamak ve post-sinaptik hücre morfolojisinin tanımlanmasını doğrulamak için enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini de açıklayacağız.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tube</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>12134102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way luer valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-30600-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine (DAB) substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PLN4X/0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35512</td>
			<td>Viral titre: 3.3x1013 GC/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>49363</td>
			<td>Focusses visual spectrum and near-IR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005*</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosillicate glass capillary</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150F-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>19008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera - Qimaging Retiga Electro</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>01-ELECTRO-M-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbachol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetasept</td>
			<td>XHG008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Andis</td>
			<td>22445</td>
			<td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimation condenser lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ACL2520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10011913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Rapid Electronics Ltd</td>
			<td>84-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6341 BNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 500 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror 600 nm long-pass</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>69901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder with side port</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>895150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET570/20x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine paint brush</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BRU2052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>DCAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>30% (w/w)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>988-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>k-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic fluorescence filter cube</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DFM1T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine ointment</td>
			<td>Teva</td>
			<td>80007150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01/00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted blue LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted green LED</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M565L3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaGTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR LED</td>
			<td>OSRAM</td>
			<td>SFH4550</td>
			<td>Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RAYLLAMB/OCT</td>
			<td>Optimal cutting temperature medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Ministar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>23-769-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>#24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-26-GH/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder for micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-1874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>OPMI 1 FR pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter for intracellular recording solution</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin citrate</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific Ltd</td>
			<td>10458842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN ABC-HRP kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinLTP</td>
			<td>https://www.winltp.com/</td>
			<td>Version 2.32</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular?</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic interrogation of long-range synaptic transmission and plasticity from medial prefrontal cortex to lateral entorhinal cortex

Beyindeki belirli sinapsların fizyolojik özelliklerini ve plastik değişikliklere nasıl maruz kaldıklarını incelemek, modern sinirbilimde önemli bir zorluktur. Geleneksel in vitro elektrofizyolojik teknikler, sinaptik iletimi uyandırmak için elektriksel stimülasyon kullanır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı, spesifik olmayan doğasıdır; uyarıcı elektrot bölgesindeki tüm aksonlar aktive edilecek ve bu da belirli bir afferent bağlantıya bir etki atfetmeyi zorlaştıracaktır. Bu sorun, elektriksel stimülasyonun optogenetik temelli stimülasyonla değiştirilmesiyle aşılabilir. Optogenetiği in vitro yama-kelepçe kayıtlarıyla birleştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu, anatomik olarak tanımlanmış hassas sinaptik bağlantıların hem bazal sinaptik iletiminin hem de sinaptik plastisitesinin incelenmesi için güçlü bir araçtır ve beyindeki hemen hemen her yola uygulanabilir. Burada, kemirgen beynindeki pre-sinaptik bir bölgeye (medial prefrontal korteks) cerrahi enjeksiyon için kanalrodopsin proteinini kodlayan bir viral vektörün hazırlanmasını ve işlenmesini ve aşağı akış hedef bölgelerinin (lateral entorinal korteks) akut dilimlerinin oluşturulmasını açıklıyoruz. Kısa ve uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyonla birleştirmek için ayrıntılı bir prosedür de sunulmaktadır. Optogenetik ve Cre-bağımlı hücre etiketlemesini birleştirerek yol ve hücre özgüllüğünü sağlayan deney örneklerini tartışıyoruz. Son olarak, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin histolojik doğrulaması, kesin konumun ve hücre tipinin daha fazla tanımlanmasına izin vermek için post-sinaptik hücrenin biyositin etiketlemesi ile birlikte açıklanmaktadır.

Bu protokolde, optogenetik yapıların viral iletimini kullanarak uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisitenin nasıl çalışılacağını açıklıyoruz. Protokol, beyindeki hemen hemen her türlü uzun menzilli bağlantıyı incelemek için çok kolay bir şekilde uyarlanabilir. Örnek olarak, bir opsini sıçan mPFC'sine kodlayan AAV'lerin enjeksiyonunu, LEC'den akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve LEC'deki mPFC terminallerinin ışıkla uyarı...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Viral olarak verilen optogenetik yapılar, akut beyin dilimlerinde spesifik sinapsların fizyolojisinin ve plastisitesinin ayrıntılı elektrofizyolojik karakterizasyonuna izin verir. Sinapsları optogenetik olarak aktive etmenin başlıca avantajları, uzun menzilli yolları inceleme yeteneği ve anatomik olarak ayrılmamış aksonların seçici uyarımıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Dr. Lisa Kinnavane olacaktır.Başlamak için, bir Hamilton şırıngasını stereotaksik bir çerçeveye monte edilmiş hareketli bir kola bağlı bir mikroenjeksiyon şırınga pompasına yükleyin. Daha sonra virüsün beş mikrolitrelik bir alikotunu bir mikrosantrifüje yerleştirin. Tüpü birkaç saniye döndürün ve viral preparatın iki mikrolitresini tüpün kapağına pipetleyin.Şırıngayı viral preparatla doldurmak için, iğne ucunu cerrahi mikroskopla görüntüleyin. Ardından, virüsün bolusunu manuel olarak iğnenin ucuna yerleştirin ve pompa kontrollerini kullanarak şırınga pistonunu geri çekin. Pompa enjeksiyon hacmini 300 nanolitreye ve akış hızını dakikada 100 nanolitreye ayarlayın.Pompayı çalıştırın ve iğne ucundaki virüs damlacığını gözlemleyerek doğru akışı onaylayın. Virüsü bir pamuk tomurcuğu üzerinde emin ve iğneyi% 70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, stereotaksik çerçeve üzerindeki ayarlayıcı vidaları kullanarak, iğne ucunu bregmaya yönlendirin ve çerçeve üzerindeki üç vernier ölçeğinde gözlenen stereotaksik ölçümleri not alın.Bu mesafeleri bregma koordinatlarına ekleyin veya buradan çıkarın. Stereotaksik kola monte edilmiş bir mikro matkap kullanarak kafatası yüzeyinde bir çapak deliği açın. İğneyi önceden belirlenmiş dorsoventral koordinatta beyne yerleştirin ve viral preparatın önceden belirlenmiş bir hacmini infüze edin.İnfüzyondan sonra, bolusun difüzyonuna izin vermek için iğneyi 10 dakika yerinde bırakın. Ardından iğneyi çıkarın ve iğnenin tıkanmadığından emin olmak için pompayı çalıştırın. Viral enjeksiyondan iki hafta sonra, sıçanı ötenazileştirin, tüm beyni hızla disseke edin ve sakkaroz kesme çözeltisine aktarın.Metal bir çay kaşığı kullanarak beyni alın, fazla çözeltiyi atın ve bir filtre kağıdına yerleştirin. Bir neşter kullanarak, beyinciği çıkarın ve koronal düzlemdeki beyincikleri uzunluğu boyunca yaklaşık yarısı kadar kesin. Arka yarısı LEC doku bloğudur.Doku bloğunu ve kalan beyni sakkaroz kesme çözeltisine geri döndürün. Daha sonra, bir vibratom aşamasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin ve ince bir tabakaya yayın. Daha sonra bir çay kaşığı kullanarak, LEC doku bloğunu seçin ve ön koronal kesimin yapışacağı şekilde tutkal yamasına aktarın.Aşamayı vibratom doku odasına takın ve dokuyu batırmak için yeterli sakkaroz kesme çözeltisini hızla dökün. Doku bloğunun ventral yüzeyini bıçağa doğru yönlendirdikten sonra, yavaş bir bıçak ilerleme hızı kullanarak ventralden sırta 350 mikrometre kalınlığındaki dilimleri kesin. Tipik olarak, yarımküre başına yedi dilim elde edilebilir.Dilimleri dilim toplama odasına aktarın. Ardından, oda sıcaklığına dönmeden önce toplama odasını bir saat boyunca 34 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Beynin geri kalanını 48 saat boyunca paraformaldehit içine yerleştirin.Hedef hücre tanımlaması için, dilimi kayıt odasına yerleştirin ve bir dilim ankrajı kullanarak hareketsiz hale getirin. Düşük büyütme altında, kızılötesi aydınlatma kullanarak, LEC beşinci katmanına gidin. Daha sonra yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine geçin ve piramidal nöronları tanımlayın.Hücrenin monitördeki konumunu bantla işaretleyin. Daha sonra, bütün bir hücre yaması kelepçesi oluşturmak için, bir borosilikat cam mikro pipet imal edin ve hücre içi kayıt çözeltisi ile doldurun. Doldurulmuş mikro pipeti elektrot tutucuya yerleştirin ve elektrot tutucu yan portuna bağlı bir ağızlığa sert üfleyerek pozitif basınç uygulayın.Mikroskop hedefini bir menisküs oluşturacak şekilde yükseltin ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin. Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve pipet direncinin üç ila beş megaohm olup olmadığını belirleyin. Ardından, tanımlanan hücreye bir pipet ucuyla dokunun ve hücre zarında girinti oluşmasına neden olun.Daha sonra, ağızlıkta emme yoluyla negatif basınç uygulayın ve pipet direncini artırın. Hücre zarı yırtılana kadar negatif basıncı kademeli olarak uygulamaya devam edin, bu da tüm hücre kapasitans geçicilerine neden olur. Mevcut kelepçe konfigürasyonuna girmek için, filtre küpleri ve uygun optiklerle mikroskop ışık yoluna yönlendirilmiş monte edilmiş bir LED kullanın ve 40X hedefi aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulayın.Presinaptik salınım özelliklerini araştırmak için beş hertz, 10 hertz ve 20 hertz'de çoklu ışık darbeli trenler teslim edin. Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin.Ardından, yaklaşma açısı boyunca pipeti yavaşça hücrenin somasından uzağa çekin, kapasitans geçicilerinin ve membran akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyerek hücre zarının yeniden kapatıldığını ve pipet ucunda bir dıştan-dışarı yama oluşumunu gösterir. Dilimi 24 delikli bir plakada paraformaldehit içine yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. OCT ortamını kullanarak, kriyostat numune diskine bir doku bloğu takın.Dokuyu dondurmak için, isopentanı uygun bir kaba yerleştirin ve numune diskini batırarak dokunun izopentan seviyesinin üzerinde olmasını sağlayın. Daha sonra izopentan kabını sıvı azota indirin ve dokunun donmasına izin verin. Doku tamamen donduktan sonra, bloğun sıcaklığının dengelenmesine izin vermek için doku bloğunu kriyostat odasında eksi 20 santigrat derecede 30 dakika bekletin.Dengelemeden sonra, kriyostattaki 40 mikrometre kalınlığındaki bölümleri kesin ve bölümleri bıçaktan çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Bu dondurulmuş bölümleri, slaytı bölümlere dokunarak oda sıcaklığında poli-L-lizin kaplı cam mikroskop slaydına yapıştırın. Her kızağa 150 mikrolitre montaj ortamı ekledikten sonra, kapak kaymasını uygulayın ve kapak kaymasına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın.Fotobeyazlatmaya karşı korumak için slaytları örtün ve 12 saat boyunca havada kurumasını bekleyin. Daha sonra bir floresan mikroskobu kullanarak, viral enjeksiyon bölgesinin yerini inceleyin. Biyositin boyama için, herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için dilimleri PBS'de% 3 hidrojen peroksit içinde 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra beyin dilimlerini PBS ile daha fazla oksijen kabarcığı görünmeyene kadar yıkayın. Daha sonra, dilimleri% 0.1 Triton X-100 içeren PBS'de% 1avidin-biyotinile HRP kompleks çözeltisinde% 1 avidin-biyotinile HRP kompleks çözeltisinde üç saat boyunca inkübe edin. Altı PBS yıkandıktan sonra, nöronal yapıların biyositin boyaması görünür hale gelene kadar her bir dilimi DAB çözeltisinde inkübe edin.Dilimleri soğuk PBS'ye aktararak reaksiyonu durdurun. Daha sonra dilimleri bir fırça kullanarak cam mikroskop slaytlarına monte edin. Fazla PBS'yi çıkardıktan sonra, montaj ortamı ekleyin.Dilimleri kapak fişlerini kullanarak örtün ve daha önce gösterildiği gibi havayla kurumasını bekleyin. Sağlıklı bir piramidal hücre yerleştirildi ve yamalandı. Post-sinaptik hücre tanımlaması gerekiyorsa, floresan belirteci eksprese eden bir hücre, geniş alan optikleri kullanılarak lokalize edilmelidir.İki milisaniyelik tek ışık darbeleri, basit dalga formu optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyellerle sonuçlandı. Sinapsın kısa süreli plastisitesi, beş, 10 ve 20 hertz ışık stimülasyon trenleri uygulanarak incelenir. Uzun süreli plastisiteyi araştırırken, 10 dakika boyunca dolaşımdaki aCSF'ye kolinerjik agonist karbaçol eklenmesi, ligandın çıkarılmasından 40 dakika sonra hala belirgin olan uzun süreli bir depresyona neden oldu.Enjeksiyon bölgesinin uzunluğu histolojik olarak incelendi. Floresan muhabir mCherry, prelimbik ve infralimbik korteksin daha derin katmanlarına lokalize edildi. Ayrıca, biyositin dolu bir hücrenin boyanması, yerini ve morfolojisini doğruladı.Bu protokolün kritik adımları, post hoc olarak doğrulanabilen afferent beyin bölgesinin doğru bir şekilde iletilmesi ve akut dilimler hazırlanırken beynin hızlı diseksiyonudur. Bu prosedür, belirli bir internöron alt sınıfı gibi bireysel bir hücre tipinin floresan etiketlemesi ile kolayca birleştirilir. Bunu yapmak için, belirli bir hücre tipinde bir rekombinazı ifade eden transgenik bir hayvan kullanacağız.Viral olarak verilen optogenetik yapılar, sistemler ve devre sinirbilimi alanlarında hızlı ilerlemelere izin vermiştir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

İnsan Prefrontal Korteks gelen fMRI Sinyallerine Davranışsal Tepkiler ilişkilendirilmesi: Görev Analizi Bilişsel Süreçler incelenmesi

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole kaynaklı çıra fare modeli

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Kombine Transkraniyal Manyetik stimülasyon ve elektroansefalografi Dorsolateral Prefrontal korteksin

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...