Som en kraftig dyremodell i nevrodegenerative og atferdsstudier, kan C.elegans brukes til å effektivt screene og evaluere giftige forbindelser mot polyglutamin nevrotoksisitet ved hjelp av Huntingtons sykdomslignende modeller. Den største fordelen med denne teknikken er profilering og integrering av flere fenotyper i forskjellige C.elegans-modeller. Også faktisk som C.elegans modeller brukes i denne metoden.
Det gir størrelse på screening og undersøkelse av terapeutiske kandidater for andre nevrodegenerative forsinkelser og faktisk andre forsinkelser. Vær oppmerksom på temperaturer som brukes i C.elegans vekst og utfør testen i de riktige stadiene av namisk utvikling. Demonstrere prosedyren vil være Jiang Yiyi, Xioa Yue, og Wang Qiangqiang, tre hovedfagsstudenter.
Begynn med å overføre 300 til 500 synkroniserte L1 larver av AM141 nematoder til hver brønn i en 48 brønnplate med 500 mikroliter S medium som inneholder OP50-stamme av E. coli og fem milligram per milliliter astragalan. Forsegl platen med parafilm og inkuber ved 20 grader Celsius og 120 rotasjoner per minutt for ønskede tidsintervaller. Overfør nematodene i et sterilt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og vask med M9-buffer tre ganger ved sentrifugering for å fjerne de resterende OP50-cellene.
Deretter resuspenderer AM141 nematoder i M9 buffer. Overfør nå 10 til 15 nematoder i hver brønn i en 384-brønnplate, sett 10 replikasjonsbrønner for hver behandling og tilsett 10 mikroliter 200 millimolært natriumazid til hver brønn for å lamme nematodene ved å la dem slå seg ned til bunnen. Plasser platen i et bildesystem med høyt innhold for å få fluorescerende bilder.
Åpne programvaren for bildeinnhenting og sett opp parametrene som er nevnt i tekstmanuskriptet. Analyser bildedataene ved å åpne vinduet for gjennomgangsplatedata og velge testplaten for bildeanalyse. Dobbeltklikk på en testbrønn for å vise bildet.
Velg deretter tellekjernene som analysemetode og klikk på konfigurer innstillinger-knappen. Definer kildebildet fra FITC-kanalen, og velg standardalgoritmen. Angi bildeanalyseparametrene som beskrevet i tekstmanuskriptet og test dem for å optimalisere analysemetoden.
Lagre innstillingene og kjør analysen på alle brønnene. Eksporter de totale kjernene som det totale antallet Q40:YFP-aggregater i hver brønn. Tell antall nematoder i hver brønn og beregn gjennomsnittlig antall Q40:YFP-aggregater per nematode i hver gruppe.
Deretter beregner du inhiberingsindeksen. For å forberede nematoder for polyQ-nevrotoksisitetsanalysen, overfør 300 til 500 synkroniserte L1-larver av HA759-nematoder til hver brønn av en 48-brønnplate med 500 mikroliter S-medium som inneholder OP50-stamme av E. coli og fem milligram per milliliter astragalan. Etter forsegling av platene, inkuber, høst og resuspender nematodene i M9-buffer som vist tidligere.
Forbered deg nå i agarosepute ved å tilsette to gram agarose til 100 ml M9-buffer og varme løsningen i en mikrobølgeovn til nær koking. Dispenser 0, 5 ml smeltet agarose på midten av en millimeter tykk mikroskopi glassglass plassert mellom to stykker av to millimeter tykke glassplater, som dekker med et annet lysbilde vertikalt. Fjern forsiktig toppsklien når agarose er avkjølt og stivnet.
Begynn ASH-nevronoverlevelsesanalysen ved å legge til en dråpe 20 millimolar natriumazid på agrosputen og deretter overføre 15 til 20 HA759 nematoder i dråpen for å immobilisere dem. Legg en dekselglide forsiktig over nematodene. Nå, hold lysbildet under et fluorescensmikroskop utstyrt med et digitalt kamera.
Velg en 40x objektivlinse og FITC-filter for å oppdage GFP-positive ASH-nevroner i hodeområdet til nematodene. Velg mer enn 50 nematoder i hver gruppe tilfeldig for å telle antall nematoder med GFP-merkede bilaterale ASH-nevroner i hodeområdet, og beregn deretter overlevelsesraten for ASH-nevroner. For den osmotiske unngåelsesanalysen, del en matfri NGM-plate i normale og fellesoner ved å lage en åtte molar glyserollinje i midten.
Deretter sprer du en 200 millimolar natriumazidlinje på rundt en centimeter fra glyserollinjen for å lamme nematodene som krysser gjennom glyserolbarrieren inn i fellesonen. Overfør rundt 200 nematoder hver til normal sone med tre replikasjonsplater for hver gruppe. Deretter legger du til en dråpe 1% butandion på fellesonen for å tiltrekke nematodene.
Dekk lokket på petriskålen umiddelbart og inkuber ved 23 grader Celsius i 90 minutter. Score antall nematoder på begge sonene under et mikroskop og beregne unngåelsesindeksen. Den transgene polyQ-stammen AM141 uttrykker sterkt Q40: YFP-fusjonsproteiner i kroppens veggmuskelceller, identifisert av denne automatiserte bildebehandlings- og analyseprotokollen, hvis økende mengde ble hemmet av astragalanbehandling som demonstrerte dets beskyttende potensial.
Et tap av GFP-fluorescens og bilaterale ASH-nevroner i hodeområdene av nematoder indikerer ASH-nevrondøden. Denne ASH-nevronale overlevelsesanalysen kan brukes til å visuelt evaluere den nevrobeskyttende effekten av testforbindelser på Caenorhabditis eleganseneuroner. Den kjemosensoriske unngåelsesanalysen ble brukt til å undersøke de effektive testprøvene på det funksjonelle tapet av ASH-nevroner mediert av polyQ-aggregering.
Unngåelsesindeksen for HA759 nematoder behandlet med astragalan ved 15 grader Celsius i tre dager økte til mer enn 0,6, noe som viste en nevrobeskyttende effekt av polysakkaridet mot atferdsforstyrrelser. For å evaluere den totale nevrobeskyttende kapasiteten til testforbindelser, ble dataene fra de enkelte analysene integrert og presentert som et radardiagram som viser triangelets areal i astragalanbehandlingsgruppen større enn kontrollgruppen, noe som indikerer anti-polyQ-effektene av polysakkaridet. Vær oppmerksom på at mat, temperatur og fuktighet kan påvirke deres oppførsel av C.elegans.
