このプロジェクトは、WNLO 2018WNLOKF023のイノベーション基金の支援を受けました。

この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、武漢大学中南病院の倫理委員会(No. 2019065)によって承認された。検体は、武漢大学(中国)中南病院血液科のMM患者から採取した。
1. BM塗抹標本の調製
<ol><li>最初の0.2 mLのBM溶液を清潔な使い捨てスライドガラスの上に置きます。</li>
	<li>BMを素早く取り外して、鋭い尾でBM塗抹標本を均一な厚さに広げます。?...

<ol>
	<li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics:+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group.">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li><li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competence+and+competition:+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell.">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li><li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma:+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis.">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li><li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+myeloma:+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process.">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li><li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma:+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2.">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li><li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service.">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li><li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology,+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li><li>&#352;tifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma.">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).</li><li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears.">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li><li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+morphology,+esterase+cytochemistry,+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears.">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li><li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultimate+Wright-Giemsa+stain:+60+years+in+the+making.">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li><li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed.">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li><li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Henry's+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book.">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li><li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders.">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li></ol>

著者らは開示するものは何もありません。

MMにおける遺伝的リスク層別化へのFISHの適用は不可欠である。FISHレポートの重要な部分は、すべての有核細胞ではなく、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって特異的に精製または同定されたクローンPCです。PCソーティングまたはcIg-FISH後の相間FISHは、BM中のPCの割合が比較的低いため、MMの診断において有意であることが判明し?...

多発性骨髄腫(MM)は、強い生物学的不均一性と臨床的有効性の大きな個人差を有する悪性形質細胞(PC)疾患であり、生存期間は数ヶ月から数十年の範囲である。細胞遺伝学的特徴は、MMの重要な予後指標である。リスク層別化システムや遺伝的特徴に基づく個別化治療は、MM1の臨床研究において大きな関心を集めています。骨髄(BM)の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)パネルで試験されたPCの収差には、del 13q14(RB1)、del 17p13(TP53)、t(4;14)(IGH/FGFR3)、t(11;14)(IGH/MYEOV)、t(14;16)(IGH/MAF)、t(14:20)(IGH/MAFB)、1q21(CKS1B)ゲイン/増幅、および1p(CDKN2C)欠失が含まれる。
標準的な中期細胞遺伝学は、MM患者の初期評価に含めるべきである。従来のGバンド核型解析は全染色体解析の利点を提供しますが、この方法の収率が低いため、多くの偽陰性の結果が得られます2。伝統的に、PCはBリンパ球分化の末期産物であるため、分裂することがほとんどできないと考えられてきました。これにより、分割画像の取得が難しくなります。長期培養(6日間)およびサイトカインによる培養物の刺激によるMMにおける細胞遺伝学的解析の改善は、新たに診断されたMM患者における細胞遺伝学的異常を同定するための有望な方法であり得る3。しかし、培養時間を6日間に延長した場合でも、MM患者の30~50%で細胞遺伝学的異常が正確に報告されました4。さらに、MMは、その予後不均一性を反映する複雑な細胞遺伝学的異常によって特徴付けられる。しかし、従来の染色体バンディング技術の分解能は低く、MMにおける染色体異常の検出を見逃し易くする可能性がある。
間相FISH、好ましくはCD138陽性磁気ビーズベースのPCソーティングまたは細胞質免疫グロブリン軽鎖κ/λによるマーキングの後、MM5,6の分析に不可欠です。CD138陽性の選択されたサンプルは、腫瘍細胞の収量を最適化するために強く推奨される。しかし、細胞遺伝学的異常を正確に定量するには、PCソーティングのために少なくとも4mLの抗凝固BMが必要です。さらに、FISHによるCD138免疫磁気ビーズソーティングまたはFISH検査による細胞質κ/λ軽鎖免疫グロブリン(cIg-FISH)の組み合わせは、多数の実験コストを増加させ、時間がかかります。
通常、PC比は、染色されたBM塗抹標本またはBM生検切片の形態学的検査から最初に評価される7,8。最高品質のBM試料(第1骨髄吸引試料)は形態学的検査に使用されるが、FISHまたは他の検出のために送られたものは、しばしば末梢血との希釈率が高い二次吸引試料である。
早くも1990年代には、BM塗抹標本が間質FISH検査に直接使用できることが複数の研究で示され、信頼性が高く再現性のある方法であることが証明されています9。末梢血のFISHやBM塗抹標本と組み合わせた細胞形態とエステラーゼ細胞化学に基づく優雅な研究は、顆粒球性白血病およびリンパ性白血病患者の染色体異常を解明するための大きな臨床的意義を確認しました10。
本明細書では、MM患者における相間FISH検出の成功を改善するための新規な方法を提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>automatic FISH machine</td>
			<td>Leica&#160; Corporation</td>
			<td>S500-24</td>
			<td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>06J49-001</td>
			<td>DAPI Counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>FISH Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probe</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>05N56-020</td>
			<td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed volume pipette</td>
			<td>Eppendorf China Ltd.</td>
			<td>M33768H</td>
			<td>10&#160; microliter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Forward Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
			<td>IMSTAR&#160; Corporation</td>
			<td>IMSTAR</td>
			<td>Karyotype Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus&#160; Corporation</td>
			<td>BX41</td>
			<td>Forward Light Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>07J05-001</td>
			<td>NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing rack</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-501</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic staining dyeing tank</td>
			<td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td>
			<td>RSJ-516</td>
			<td>&#160;24 slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Cement</td>
			<td>Marabu&#160;GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>FixoGum&#160;</td>
			<td>Rubber Cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>Abbott Molecular Inc.</td>
			<td>02J10-032</td>
			<td>20&#215;SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>DK-8D</td>
			<td>Multiple Temperature Water bath</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interphase fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears of multiple myeloma

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)検出は、最も一般的な血液悪性腫瘍の1つである多発性骨髄腫(MM)における遺伝的リスク層別化に不可欠な方法である。MMの同定特徴は、骨髄中に悪性形質細胞が蓄積されたことである。MMに関するFISHの報告は、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって、すべての有核細胞ではなく、精製または同定されたクローン形質細胞に主に焦点を当てています。骨髄間相核は、通常、新鮮な骨髄細胞から得られる。しかし、形質細胞検体の十分な濃縮には、大量の新鮮なヘパリン抗凝固骨髄が必要であり、これは困難な骨髄抽出や骨髄ドライタップの場合には得られない。本明細書では、染色または未染色の骨髄塗抹標本に対するFISH検出の成功を改善するための新規な方法を確立する。骨髄塗抹標本は、抗凝固骨髄標本よりも入手が容易である。

新たに診断されたMM患者の初期形態学的評価では、BM塗抹標本中のPCの15%が、通常のPCよりも大量の細胞質とともに、より大きくて暗い核を有することが判明した(図2A)。イムノ表現型技術によって検出されたヘパリン抗凝固BMの最初のチューブは、モノクローナル異常PCのわずか2.3%しか明らかにしなかった。ただし、吸引BMは、それがドライタップである場合に制限されて...

Watch this Scientific Journal Video about Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma at JoVE.com

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

ここでは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄塗抹標本に対する相間蛍光 in situ ハイブリダイゼーション検出の成功を改善するためのプロトコールを提示する。

多発性骨髄腫の骨髄塗抹標本の その場での 相間蛍光ハイブリダイゼーション

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

FISHと呼ばれる蛍光In situハイブリダイゼーションを多発性骨髄腫における遺伝的リスク層別化に適用することは不可欠です。FISHレポートの重要な部分は、すべての有核細胞ではなく、抗CD138磁気ビーズで選別するか、またはcIg FISHと呼ばれるFISH試験で細胞質カッパまたはラムダ軽鎖免疫グロブリンでマーキングすることによって、特異的に精製または同定されたクローン形質細胞である。形質細胞選別またはcIg FISH後の相間FISHは、骨髄中の形質細胞の割合が比較的低いため、多発性骨髄腫の診断において有意であることが判明した。しかし、これらの方法には、複雑なプロセス、高い試料要求、高い実験コストなど、いくつかの欠点があります。形質細胞は、骨髄塗抹標本中に迅速に配置することができる。これに基づき、骨髄塗抹標本FISHを用いて多発性骨髄腫細胞を検出した。この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、武漢大学中南病院の倫理委員会によって承認された。検体は、中国武漢大学中南病院血液科の多発性骨髄腫患者から採取した。最初の0.2ミリリットルの骨髄溶液を清潔な使い捨てスライドガラスの上に置き、骨髄を素早く取り外してから自然に乾燥させることによって、骨髄塗抹標本を均一な厚さと鋭い尾に広げる。骨髄フィルムを1ミリリットルのライト・ギムザ溶液で室温で約10秒間覆う。1ミリリットルのリン酸緩衝液をスライドに加え、色素溶液がスライドから乾燥または流出するのを防ぐために注意が必要であった。色素溶液を穏やかに混合し、室温で15分間維持する。スライドをきれいな水ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。悪性形質細胞を検出するために前方光顕微鏡を使用して、形質細胞はよく分散している必要があります。今、私たちが現場で見ているのは、かなり分散している形質細胞です。これは典型的な二核核プラズマセルです。ハイブリダイズした領域を固定液で10分間覆い、形質細胞を変色させて固定する。スライドをイオン交換水ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。2回のSSC緩衝液を含むジャーを水浴中で摂氏56度に予熱する。調製した骨髄塗抹標本を予熱した2回SSC緩衝液で10分間洗浄し、続いて室温の脱イオン水に浸漬した。エタノール勾配70%85%および100%エタノールでそれぞれ1分間塗抹標本を脱水する。塗抹標本を空気中で10分間乾燥させる。まず、17番染色体プローブ混合物のセントロメア上のTP53をハイブリダイゼーション領域に加え、それをカバースリッププレスで覆い、細かい尖ったピンセットを優しく覆い、下から気泡を除去する。カバースリップのすべての側面をゴムセメントでシールして、良好な気密性を確保します。ゴム糊の固化後、スライドを自動FISHマシンに載せて変性を78°Cで5分間行い、続いて37°Cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。FISHマシンからスライドを拾います。細かい尖ったピンセットを使用してゴムセメントを優しく取り除きます。スライドを室温で2回SSCに約1〜2分間浸し、カバーの滑りを洗い流します。スライドを68°Cの予熱バッファーで水浴中で2分間洗浄します。スライドを37°Cの水浴中で2回SSCで1分間洗浄します。ハイブリダイズした領域に10マイクロリットルのDAPIで10分間十分に乾燥させるために暗闇の中で右にセットアップし、カバースリップで覆う。蛍光顕微鏡上に設定された適切なフィルターを用いてハイブリダイズスライドを表示し、単色青色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、細胞核の蛍光強度を観察した。DAPIフィルタセットの下で細胞核画像を撮影する。CEP17は緑色蛍光で標識された。スペクトル緑色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、CEP17の位置を観察します。緑色のフィルタセットの下でCEP17信号画像を撮ります。TP53遺伝子を橙色蛍光で標識した。スペクトルオレンジ色の蛍光色素光学フィルターを使用してTP53を観察し、TP53信号画像をセットの下で撮影し、これら3つの画像全体をマージし、数値異常を調べます。正常な相間細胞では、1対の正常な染色体17を示す青色蛍光を有する2つのオレンジ色および2つの緑色のシグナルが核内に観察される。結果は、多発性骨髄腫患者における骨髄の形態および遺伝学を示した。図Aは、骨髄塗抹標本中の形質細胞の15%が、通常よりも大量の細胞質と共に、より大きくかつ暗くかつ核を有することが見出されたことを示した。図Bは、骨髄塗抹標本における有核形質細胞による代表のグレースケール画像を示した。図Cは、形質細胞の1つの相間核において4つのオレンジ色および4つの緑色のシグナルを示し、第17染色体の4つのコピーが核内に局在していたことを示唆している。図Dは、この患者の異常な染色体核像が1つの核に2対の染色体17を確認したことを示した。骨髄塗抹標本は、抗凝固骨髄を得るために核を得るために複雑な手順を必要とするため、抗凝固剤骨髄標本よりもはるかに入手が容易である。そこで、多発性骨髄腫細胞の検出のための骨髄塗抹標本FISHの説得力のある方法を確立した。

interphase-fluorescence-situ-hybridization-bone-marrow-smears

Research

JoVE Journal

Medicine

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

4.0K Views.  Zhongnan Hospital of Wuhan University. The application of Fluorescence In Situ Hybridization called FISH to genetic risk stratification in multiple myeloma is essential. The critical part of FISH reports is not all nucleated cells, but clonal plasma cells specifically purified or identified by sorting with anti-CD138 magnetic beads or marking with cytoplasmic kappa or Lambda light chain immunoglobulin with FISH testing called cIg FISH. Interphase FISH after plasma cell sorting or cIg FISH turns out to be significant in the diagnos...

多発性骨髄腫の骨髄塗抹標本の その場での 相間蛍光ハイブリダイゼーション

多発性骨髄腫の骨髄塗抹標本のその場での相間蛍光ハイブリダイゼーション