10.1K Views
•
12:03 min
•
June 10th, 2022
DOI :
June 10th, 2022
•0:05
Introduction
0:55
Pathology Review
4:11
Preparation for TMA Construction
5:36
Core Placement
6:34
Completing the TMA
7:37
Validating the TMA
8:24
Results
11:25
Conclusions
Transcript
Vævsmikroarrayet, eller TMA, er et vigtigt forskningsværktøj, der samler små eksemplariske stykker væv kendt som vævskerner fra formalinfikerede paraffinindlejrede vævsblokke, kaldet donorblokke, i en enkelt paraffinblok. Båndmetoden er en fuldt manuel konstruktionsmetode, der inverterer byggeprocessen ved at støbe blokken rundt om opretstående kerner og er således kompatibel med ikke-ideelle donorblokke og bruger billige, bredt tilgængelige engangs håndholdte vævsmikroarrayers. Flertrinsarbejdsgangen i denne proces vil blive demonstreret af Lee Wisner og Dr. Brandon Larsen.
Et af de vigtigste begreber at huske, når man konstruerer TMA-blokke, er det faktum, at væv i formalinfaste paraffinindlejrede vævsblokke faktisk er tre = dimensionelle strukturer. Vi har udviklet en animation her for at hjælpe med at forklare dette koncept. Det, du ser her, er en animation, der skildrer en formalin-fast paraffinindlejret vævsblok, der viser den tredimensionelle karakter af det væv i blokken.
Du kan se, at vævet er synligt øverst på blokken, og at området er ret stort. Hvis vi var i stand til at have røntgensyn, som det var, og se gennem blokken, ville vi måske se, at vævet faktisk ikke er ensartet formet dybere inde i den blok, næsten som et isbjerg i havet, hvor det, du ser på overfladen, måske ikke faktisk repræsenterer det, der er nedenunder. Inden for denne vævsblok kan der være yderligere vævsstykker, der ikke er synlige på overfladen.
Der kan være områder med nekrose eller vævsdød i midten af vævet dybere nede. En patolog bør faktisk gennemgå det todimensionelle afsnit fra toppen af vævsblokken og derefter kommentere det dias for at vise de områder, der indeholder vævet af interesse og udelukke nekrose eller andre typer væv, der faktisk ikke er af interesse. For at lette korrekt kerneprøveudtagning af vævet skal patologen gøre tre ting.
For det første vil patologen ved hjælp af en diasmarkeringspen markere vævet af interesse på diaset, så andre væv kan undgås. For det andet, hvis der er områder inden for dette interesseområde, der bør undgås, kan patologen bruge den samme markeringspen til at udslette de områder, der ikke bør udtages prøver af. Og endelig, helst ved hjælp af en anden farve pen, bør patologen markere de områder, der er ideelle inden for interesseområdet for kerneprøveudtagning og TMA-konstruktion.
Det er vigtigt at huske på, at når denne proces er færdig, kan vævssammensætningen ændre sig dybere inde fra, hvor en kerneprøve opnås, og vi viser dette her i animationen, at kernens placering bestemmer sammensætningen af den kerne, som vil variere efter vævets dybde og hvad der er til stede i den blok. For eksempel er den første kerne, som vi illustrerer, her at fange en del af vævet i sin øverste halvdel, men dybere inde i blokken er der ikke længere noget væv til stede, hvor kernen er opnået fra, så kun paraffinvoks er blevet udtaget. Den anden kerne, vi har illustreret her, har fanget væv i hele sin længde, fordi væv er til stede i hele dybden af den blok på det sted.
Den tredje kerne har fanget en del af vævet og har derefter fanget en del paraffinvoks i midten, hvor der ikke var noget væv til stede, og derefter fanget lidt mere væv i den nederste ende, hvor der var væv i den nederste del af blokken. Når patologigennemgangen er afsluttet, skal du udarbejde den endelige liste over donorblokke, der skal bruges i TMA-konstruktionen, og derefter oprette et TMA-kort. TMA-kortet er en skematisk skitse, hvor kernerne vil være placeret i de færdige TMA- og diasmonterede vævssektioner skåret fra den resulterende TMA.
Af orienteringsøjemed skal du sikre, at TMA-kortet undgår at placere kerner i en jævn matrix, såsom en tre-fire-fire-fire-matrix, og at det indeholder mindst én orienteringsmarkør. Fordi båndmetoden vender byggeprocessen om ved at hælde smeltet voks rundt om de omvendte kerner, nødvendiggør dette oprettelsen af et andet kort kendt som et konstruktionskort, som er et spejlbillede af TMA-kortet. Konstruktionskortet viser, hvor hver kerne skal placeres under konstruktionen for at kunne vises på den rigtige placering i den færdige TMA.
Når kortene er oprettet, skal du forberede TMA-basisformen af metal. For at styre kerneplaceringen skal du bruge et engangspapir ternet gitter. Skær det papirternede gitter i størrelse, og sæt et stykke dobbelttape på bagsiden af gitteret.
Placer gitteret og båndet i metalbakken, og tilføj et andet stykke dobbelttape oven på gitteret. Overlejr det patologisk gennemgåede H & E-dias på FFPE-vævsblokken, der skal stanses, og brug patologens markeringer til at identificere, hvor vævsblokken skal stanses. Brug en håndholdt manuel kernestans, engangs eller genanvendelig, til at slå FFPE-donorblokken i det relevante område.
Hvis du bruger en genanvendelig kernestans, skal du sørge for, at den rengøres før og efter hvert vævsslag. Skub kernen ud af kernestansen. Brug en nålestikker til at placere den udslyngede kerne på trådkorset på det dobbeltklæbende tapedækkede gitter.
Sørg for, at kernen er placeret på en omvendt, opretstående måde, således at vævsenden af kernen kommer i kontakt med båndet og er på det rigtige sted som angivet på konstruktionskortet. Gentag, indtil alle donorblokke er kernet, og kernerne er placeret på deres passende positioner. Når alle kernerne er på plads, skal du mærke en plastkassette og placere den oven på metalbasen, der indeholder kernerne.
Kernernes højde må ikke overstige metalbakkens dybde, da høje kerner vippes eller væltes, når kassetten sættes på plads. Hæld forsigtigt smeltet paraffin gennem kassetten i bakken med kerner. Lad den smeltede paraffin flyde over for at sikre, at der ikke er luftbobler i TMA's krop.
Sørg for, at paraffinen fyldes til toppen af kassetten, således at kassetten er indlejret og fast bundet til paraffinblokken, når den er størknet. Lad blokken afkøle ved stuetemperatur i 30 minutter, og flyt ikke blokken i løbet af denne tid. Opbevares i køleskab ved fire grader Celsius i yderligere 30 minutter for at størkne fuldstændigt.
Når den er helt indstillet, skal du forsigtigt adskille metalbasiformen og fjerne dobbeltpindsbåndet fra paraffinblokken. Når TMA er konstrueret, skal du bruge et mikrotom til at sektionere den nye TMA. Når blokken er blevet passende vendt, skal du samle vævssektioner med hele ansigtet.
Overfør sektionerne til et forvarmet vandbad og skub vævssektionerne. Når det er tørt, skal du indsende repræsentative sektioner til H & E-farvning og eventuelle yderligere immunohistokemiske pletter, der måtte være nødvendige. Indsend de farvede TMA-sektioner til patologisk gennemgang.
Til TMA-validering skal patologen gennemgå H & E-diaset fra TMA-blokken og gennemgå hvert cirkulært sted under mikroskopet for at se, om vævet af interesse er til stede. En kritisk komponent i byggeprocessen er identifikation af væv af interesse i en given donorblok, hvorfra TMA-kernen skal udtages. Den første kolonne i denne figur viser eksemplariske donor H&Es med patologens markeringer.
Den anden kolonne viser det stansede område af H & E farvede væv. Den tredje kolonne viser H&E-farvet væv i TMA-kernerne, der blev høstet fra donorblokkene i de områder, der er vist i kolonne et og to. Patologen kan se den matchede donorblok og TMA-kerne H&Es sammen for at validere, at interesseområdet blev indsamlet, og at vævssammensætningen er den samme.
Der er to principielle målinger for en vellykket gennemførelse af en TMA ved hjælp af båndmetoden. Den første er tilstedeværelsen af vævskerne prikker på de forventede positioner og afstand fra hinanden, som vurderes ved visuel inspektion. Billederne vist i A og B viser to vellykkede båndmetode TMA'er og de tilsvarende H&E-dias.
Visuelle inspektioner af disse TMA-blokke viser, at kernerne er til stede og regelmæssigt fordelt i hver TMA og deres tilsvarende sektioner. Nogle af de vigtigste konstruktionsproblemer, der kan opstå under båndmetodekonstruktionsprocessen, omfatter adskillelse af blokken og kassetten på grund af for tidlig fjernelse af metalbasen inden størkning, som vist på billede C.Core vælter og / eller placeringsdrift af de indlejrede kerner som vist på billede D kan forekomme, mens overdreven turbulent hældning af den smeltede paraffin, som kan forværres af dårligt klæbende dobbeltsidet tape. Denne figur viser, at H&E-pletten for hver af kernerne er en eksemplarisk TMA.
Alle undtagen et af kernepunkterne er til stede i H&E. Figuren viser også, at nogle af kernerne er til stede som komplette cirkulære vævspr prikker, mens andre ikke er helt til stede. Et sådant vævstab er ikke ualmindeligt og kan skyldes utilstrækkelig blokvending til at afsløre alle kerner fuldt ud.
Alternativt kan tilstedeværelsen af ufuldstændig eller det totale fravær af væv skyldes dårlig vævskvalitet af denne kerne, hvilket kan resultere i vævstab under farvningsprocessen. I denne næste figur blev immunhistokemi og RNA ISH-farvning udført på TMA-sektionerne for yderligere at validere TMA. Som vist her kan en række pletter anvendes afhængigt af det væv, der bruges til at konstruere TMA.
Vimentin bruges som kvalitetskontrol. U6 er en indikator for RNA-kvalitet. EBER bruges til at bestemme EBV-status.
Og CD20 er en B-cellemarkør for at indikere tilstedeværelsen af B-celler. Dette er et par pletter, der kan bruges til at hjælpe med at validere din TMA. Når du har set denne video, skal du forstå, hvordan man laver et vævsmikroarray ved hjælp af båndmetoden, og hvorfor TMA'er er vigtige tids- og ressourcebesparende forskningsværktøjer.
Du bør også forstå, at TMA-konstruktion ikke er en ideel proces, og at fortsat patologisk vejledning og gennemgang er kritiske komponenter ikke kun under byggeprocessen, men også til immunohistokemiske undersøgelser udført på TMA-sektioner for at sikre, at vævet af interesse faktisk er til stede i TMA-sektionen.
Denne protokol skitserer båndmetoden til, hvordan man manuelt konstruerer et vævsmikroarray ved hjælp af FFPE-donorblokke med forskellige dybder.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved