Handmatige constructie van een weefselmicroarray met behulp van de tapemethode en een handheld microarrayer

De weefselmicroarray, of TMA, is een belangrijk onderzoeksinstrument dat kleine voorbeeldige stukjes weefsel assembleert die bekend staan als weefselkernen van formaline-gefixeerde paraffine ingebedde weefselblokken, aangeduid als donorblokken, in een enkel paraffineblok. De tapemethode is een volledig handmatige bouwmethode die het bouwproces omkeert door het blok rond rechtopstaande kernen te gieten en is dus compatibel met niet-ideale donorblokken en maakt gebruik van goedkope, algemeen verkrijgbare wegwerpbare handheld weefselmicroarrayers. De meerstapsworkflow van dit proces zal worden gedemonstreerd door Mr.Lee Wisner en Dr.Brandon Larsen.

Een van de belangrijkste concepten om te onthouden bij het construeren van TMA-blokken is het feit dat weefsels in formaline-gefixeerde paraffine ingebedde weefselblokken eigenlijk drie = dimensionale structuren zijn. We hebben hier een animatie ontwikkeld om dit concept uit te leggen. Wat je hier ziet, is een animatie van een formaline-gefixeerd paraffine ingebed weefselblok dat de driedimensionale aard van dat weefsel in het blok laat zien.

Je kunt zien dat het weefsel zichtbaar is aan de bovenkant van het blok en dat gebied is vrij groot. Als we als het ware röntgenzicht zouden kunnen hebben en door het blok heen zouden kunnen kijken, zouden we kunnen zien dat het weefsel niet echt uniform is gevormd dieper in dat blok, bijna als een ijsberg in de oceaan, waar wat je op het oppervlak ziet misschien niet echt vertegenwoordigt wat eronder is. Binnen dat weefselblok kunnen er extra weefselstukken zijn die niet zichtbaar zijn op het oppervlak.

Er kunnen gebieden van necrose of weefseldood zijn in het midden van dat weefsel dieper naar beneden. Een patholoog zou eigenlijk dat tweedimensionale gedeelte van de bovenkant van dat weefselblok moeten bekijken en vervolgens die dia moeten annoteren om de gebieden te laten zien die het weefsel van belang bevatten en necrose of andere soorten weefsel uitsluiten die niet echt van belang zijn. Om een goede kernbemonstering van het weefsel te vergemakkelijken, moet de patholoog drie dingen doen.

Eerst zal de patholoog met behulp van een diamarkeringspen het weefsel van belang op de dia markeren, zodat andere weefsels kunnen worden vermeden. Ten tweede, als er gebieden binnen dat interessegebied zijn die moeten worden vermeden, kan de patholoog dezelfde markeerpen gebruiken om die gebieden uit te wissen die niet mogen worden bemonsterd. En ten slotte, bij voorkeur met behulp van een andere kleur pen, moet de patholoog die gebieden markeren die ideaal zijn binnen het interessegebied voor kernbemonstering en TMA-constructie.

Het is belangrijk om in gedachten te houden dat wanneer dat proces is voltooid, de weefselsamenstelling dieper van binnenuit kan veranderen van waar een kernmonster wordt verkregen en we zullen dit hier in de animatie laten zien, dat de locatie van de kern de samenstelling van die kern zal bepalen, die zal variëren door de diepte van het weefsel en wat er in dat blok aanwezig is. Hier is bijvoorbeeld de eerste kern die we illustreren het vastleggen van een deel van het weefsel in de bovenste helft, maar dieper in het blok is er geen weefsel meer aanwezig waar die kern vandaan komt, dus alleen paraffine is bemonsterd. De tweede kern die we hier hebben geïllustreerd, heeft weefsel over de hele lengte gevangen omdat weefsel aanwezig is over de hele diepte van dat blok op die locatie.

De derde kern heeft een deel van het weefsel gevangen en vervolgens een deel van paraffine in het midden gevangen waar geen weefsel aanwezig was en vervolgens een beetje meer weefsel aan het onderste uiteinde gevangen waar er weefsel in het onderste deel van dat blok zat. Zodra de pathologiebeoordeling is voltooid, stelt u de definitieve lijst samen met donorblokken die in de TMA-constructie moeten worden gebruikt en maakt u vervolgens een TMA-kaart. De TMA-kaart is een schema dat schetst waar de kernen zich zullen bevinden in de voltooide TMA en op dia gemonteerde weefselsecties die uit de resulterende TMA zijn gesneden.

Zorg er voor oriëntatiedoeleinden voor dat de TMA-kaart het plaatsen van kernen in een gelijkmatige matrix zoals een matrix van drie bij drie of vier bij vier vermijdt en ten minste één oriëntatiemarkering bevat. Omdat de tapemethode het bouwproces omkeert door gesmolten was rond de omgekeerde kernen te gieten, vereist dit de creatie van een tweede kaart die bekend staat als een bouwkaart die een spiegelbeeld is van de TMA-kaart. De bouwkaart laat zien waar elke kern tijdens de bouw moet worden geplaatst om op de juiste locatie in de voltooide TMA te verschijnen.

Zodra de kaarten zijn gemaakt, bereidt u de metalen TMA-basismal voor. Gebruik voor de plaatsing van de kern een wegwerppapier geblokt raster. Knip het papier geblokte raster op maat en plak een stuk dubbel plakband op de achterkant van het rooster.

Plaats het rooster en de tape in de metalen bak en voeg een tweede stuk dubbel plakband toe aan het rooster. Leg de door de pathologie beoordeelde H & E-dia op het FFPE-weefselblok om te worden geponst en gebruik de markeringen van de patholoog om te identificeren waar het weefselblok moet worden gestanst. Gebruik een handheld handmatige kernpons, wegwerpbaar of herbruikbaar, pons het FFPE-donorblok in de juiste regio.

Als u een herbruikbare kernpons gebruikt, zorg er dan voor dat deze voor en na elke weefselpons wordt gereinigd. Werp de kern uit de kernstoot. Gebruik een naaldprikker om de uitgeworpen kern op het vizier van het met tape beklede rooster met dubbele stick te plaatsen.

Zorg ervoor dat de kern op een omgekeerde, rechtopstaande manier wordt geplaatst, zodat het weefseluiteinde van de kern contact maakt met de tape en zich op de juiste locatie bevindt zoals aangegeven door de bouwkaart. Herhaal dit totdat alle donorblokken zijn gekernd en de kernen op hun juiste posities zijn geplaatst. Zodra alle kernen op hun plaats zitten, labelt u een plastic cassette en plaatst u deze bovenop de metalen basis met de kernen.

De hoogte van de kernen mag de diepte van de metalen bak niet overschrijden, omdat hoge kernen worden gekanteld of omgevallen wanneer de cassette op zijn plaats wordt geplaatst. Giet zachtjes gesmolten paraffine door de cassette in de lade met kernen. Laat de gesmolten paraffine overlopen om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het lichaam van de TMA zijn.

Zorg ervoor dat de paraffine zich tot aan de bovenkant van de cassette vult, zodat de cassette is ingebed en stevig aan het paraffineblok is gebonden zodra deze is gestold. Laat het blok gedurende 30 minuten afkoelen bij kamertemperatuur en beweeg het blok gedurende deze tijd niet. Koel het blok nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius om volledig te stollen.

Eenmaal volledig ingesteld, scheidt u voorzichtig de metalen basismal en verwijdert u de dubbelsticktape van het paraffineblok. Zodra de TMA is geconstrueerd, gebruikt u een microtoom om de nieuwe TMA te sectieren. Zodra het blok op de juiste manier is geconfronteerd, verzamelt u volledige weefselsecties.

Breng de secties over naar een voorverwarmd waterbad en schuif de weefselsecties. Eenmaal droog, dient u representatieve secties in voor H & E-kleuring en eventuele extra immunohistochemische vlekken die nodig kunnen zijn. Dien de gekleurde TMA-secties in voor pathologische beoordeling.

Voor TMA-validatie moet de patholoog de H & E-dia van het TMA-blok bekijken en elke cirkelvormige plek onder de microscoop bekijken om te zien of het weefsel van belang aanwezig is. Een cruciaal onderdeel van het bouwproces is de identificatie van weefsels die van belang zijn in een bepaald donorblok van waaruit de TMA-kern moet worden verkregen. De eerste kolom van deze figuur toont voorbeeldige donor H&Es met de markeringen van de patholoog.

De tweede kolom toont het gestanste gebied van de H & E-gekleurde weefsels. De derde kolom toont het H & E-gekleurde weefsel van de TMA-kernen die werden geoogst uit de donorblokken in de gebieden die worden weergegeven in kolommen één en twee. De patholoog kan het gematchte donorblok en de TMA-kern H&Es samen bekijken om te valideren dat het interessegebied is verzameld en dat de weefselsamenstelling hetzelfde is.

Er zijn twee hoofdmetrieken voor het succesvol voltooien van een TMA door de tapemethode. De eerste is de aanwezigheid van weefselkernpunten op de verwachte posities en afstand van elkaar, die wordt beoordeeld door visuele inspectie. De afbeeldingen in A en B tonen twee succesvol voltooide tapemethode TMA's en de bijbehorende H&E-dia's.

Visuele inspecties van deze TMA-blokken laten zien dat de kernen aanwezig zijn en regelmatig verdeeld zijn in elke TMA en de bijbehorende secties. Enkele van de belangrijkste constructieproblemen die zich kunnen voordoen tijdens het bouwproces van de tapemethode zijn scheiding van het blok en de cassette als gevolg van voortijdige verwijdering van de metalen basis voorafgaand aan de stolling, zoals weergegeven in afbeelding C.Core toppling en / of plaatsingsdrift van de ingebedde kernen zoals weergegeven in afbeelding D kan optreden terwijl overmatig turbulent gieten van de gesmolten paraffine, wat kan worden verergerd door slecht klevende dubbelzijdige plakband. Deze figuur laat zien dat de H&E-vlek voor elk van de kernen een voorbeeldige TMA is.

Op één na zijn alle kernplekken aanwezig in de H&E. De figuur laat ook zien dat sommige kernen aanwezig zijn als volledige cirkelvormige weefselpunten, terwijl andere niet volledig aanwezig zijn. Dergelijk weefselverlies is niet ongewoon en kan te wijten zijn aan onvoldoende blokbekleding om alle kernen volledig te onthullen.

Als alternatief kan de aanwezigheid van onvolledig of de totale afwezigheid van weefsel voortkomen uit een slechte weefselkwaliteit van die kern, wat kan leiden tot weefselverlies tijdens het kleuringsproces. In deze volgende figuur werd immunohistochemie en RNA ISH-kleuring uitgevoerd op de TMA-secties om de TMA verder te valideren. Zoals hier getoond, kunnen verschillende vlekken worden gebruikt, afhankelijk van het weefsel dat wordt gebruikt om de TMA te construeren.

Vimentin wordt gebruikt als kwaliteitscontrole. U6 is een indicator van de RNA-kwaliteit. EBER wordt gebruikt om de EBV-status te bepalen.

En CD20 is een B-cel marker om de aanwezigheid van B-cellen aan te geven. Dit zijn een paar vlekken die kunnen worden gebruikt om uw TMA te valideren. Na het bekijken van deze video moet u begrijpen hoe u een weefselmicroarray kunt maken met behulp van de tapemethode en waarom TMA's belangrijke tijd- en middelenbesparende onderzoeksinstrumenten zijn.

U moet ook begrijpen dat TMA-constructie geen ideaal proces is en dat voortdurende pathologische begeleiding en beoordeling kritieke componenten zijn, niet alleen tijdens het bouwproces, maar ook voor immunohistochemische studies uitgevoerd op TMA-secties om ervoor te zorgen dat het weefsel van belang in feite aanwezig is in de TMA-sectie.