Vevmikroarray, eller TMA, er et viktig forskningsverktøy som samler små eksemplariske vevsstykker kjent som vevskjerner fra formalinfaste parafinbaserte vevsblokker, referert til som donorblokker, i en enkelt parafinblokk. Tapemetoden er en helt manuell konstruksjonsmetode som inverterer byggeprosessen ved å kaste blokken rundt oppreiste kjerner og dermed er kompatibel med ikke-ideelle donorblokker og bruker billige, allment tilgjengelige engangs håndholdte vevmikroarrayere. Arbeidsflyten for flere trinn i denne prosessen vil bli demonstrert av Mr.Lee Wisner og Dr.Brandon Larsen.

Et av de viktigste konseptene å huske når du konstruerer TMA-blokker er det faktum at vev i formalin-faste paraffin innebygde vevsblokker faktisk er tre = dimensjonale strukturer. Vi har utviklet en animasjon her for å forklare dette konseptet. Det du ser her er en animasjon som viser en formalin-fast parafin innebygd vev blokk som viser den tredimensjonale naturen til det vevet i blokken.

Du kan se at vevet er synlig på toppen av blokken, og det området er ganske stort. Hvis vi var i stand til å ha røntgensyn, som det var, og se gjennom blokken, kan vi se at vevet faktisk ikke er jevnt formet dypere inne i den blokken, nesten som et isfjell i havet, hvor det du ser på overflaten kanskje ikke representerer det som er under. Innenfor vevsblokken kan det være flere vevstykker som ikke er synlige på overflaten.

Det kan være områder med nekrose eller vevsdød i midten av vevet dypere ned. En patolog bør faktisk gjennomgå den todimensjonale delen av toppen av vevsblokken og deretter kommentere det lysbildet for å vise områdene som inneholder vevet av interesse og unntatt nekrose eller andre typer vev som faktisk ikke er av interesse. For å lette riktig kjerneprøvetaking av vevet, bør patologen gjøre tre ting.

For det første, ved hjelp av en lysbildemarkeringspenn, vil patologen markere vevet av interesse på lysbildet slik at andre vev kan unngås. For det andre, hvis det er områder innenfor det interesseområdet som bør unngås, kan patologen bruke den samme merkepennen til å utslette de områdene som ikke bør prøves. Og til slutt, fortrinnsvis ved hjelp av en annen farge på penn, bør patologen markere de områdene som er ideelle innenfor interesseområdet for kjerneprøvetaking og TMA-konstruksjon.

Det er viktig å huske på at når den prosessen er gjort at vevssammensetningen kan endres dypere innenfor der en kjerneprøve er oppnådd, og vi vil vise dette her i animasjonen, at plasseringen av kjernen vil bestemme sammensetningen av den kjernen, som vil variere etter dybden av vevet og hva som er tilstede i den blokken. For eksempel, her er den første kjernen vi illustrerer å fange en del av vevet i sin øvre halvdel, men dypere i blokken er det ikke lenger noe vev til stede der kjernen er hentet fra, så bare parafinvoks har blitt samplet. Den andre kjernen vi har illustrert her har fanget vev langs hele lengden fordi vev er til stede gjennom hele dybden av den blokken på det stedet.

Den tredje kjernen har fanget en del av vevet og har deretter fanget en del av parafinvoks i midten der det ikke var vev til stede og deretter fanget litt mer vev i den nederste enden der det var vev i den nederste delen av blokken. Når patologigjennomgangen er fullført, kompiler den endelige listen over donorblokker som skal brukes i TMA-konstruksjonen, og opprett deretter et TMA-kart. TMA-kartet er en skjematisk disposisjon der kjernene vil være plassert i de ferdige TMA- og lysbildemonterte vevsseksjonene kuttet fra den resulterende TMA.

For orienteringsformål må du sørge for at TMA-kartet unngår å plassere kjerner i en jevn matrise, for eksempel en matrise på tre til tre eller fire ganger fire, og inkluderer minst én retningsmarkør. Fordi tapemetoden inverterer byggeprosessen ved å helle smeltet voks rundt de omvendte kjernene, krever dette opprettelsen av et annet kart kjent som et konstruksjonskart som er et speilbilde av TMA-kartet. Konstruksjonskartet viser hvor hver kjerne må plasseres under konstruksjonen for å vises på riktig sted i den fullførte TMA.

Når kartene er opprettet, klargjør du metall-TMA-baseformen. For å veilede kjerneplassering, bruk et engangspapir rutete rutenett. Klipp det papir rutete rutenettet i størrelse og fest et stykke dobbeltpinnebånd på baksiden av rutenettet.

Legg gitteret og tapen i metallbrettet og legg til et ekstra stykke dobbeltpinnebånd på toppen av rutenettet. Overlegg den patologi-gjennomgåtte H&E-sklien på FFPE-vevsblokken som skal stanses, og bruk patologens markeringer for å identifisere hvor vevsblokken skal stanses. Bruk en håndholdt manuell kjernestans, engangs- eller gjenbrukbar, slå FFPE-donorblokken i riktig region.

Hvis du bruker en gjenbrukbar kjernestans, må du sørge for at den rengjøres før og etter hvert vevsstans. Løs ut kjernen fra kjernestansen. Bruk en nålplukk for å plassere den utkastede kjernen på trådkorset på det dobbeltpinnebånddekkede rutenettet.

Forsikre deg om at kjernen er plassert på en invertert, oppreist måte slik at vevsenden av kjernekontaktene båndet og er på riktig sted som betegnet av konstruksjonskartet. Gjenta til alle donorblokker er kjerne og kjernene er plassert i deres passende posisjoner. Når alle kjernene er på plass, merker du en plastkassett og plasserer den på toppen av metallbasen som inneholder kjernene.

Høyden på kjernene bør ikke overstige dybden på metallbrettet, da høye kjerner vil bli vippet eller veltet når kassetten er satt på plass. Hell forsiktig smeltet paraffin gjennom kassetten i brettet av kjerner. La den smeltede parafinen overløpe for å sikre at det ikke er luftbobler i TMA-kroppen.

Påse at parafinen fylles til toppen av kassetten slik at kassetten er innebygd og godt bundet til parafinblokken når den er størknet. La blokken avkjøles ved romtemperatur i 30 minutter og ikke flytt blokken i løpet av denne tiden. Kjøl blokken ved fire grader Celsius i ytterligere 30 minutter for å fullstendig størkne.

Når metallbaseformen er helt innstilt, skiller du den og fjerner dobbeltpinnebåndet fra parafinblokken. Når TMA er konstruert, bruk en mikrotom til å seksjonere den nye TMA. Når blokken har blitt riktig møtt, samle full-face vev seksjoner.

Overfør seksjonene til et forvarmet vannbad og skyv vevsdelene. Når det er tørt, send inn representative seksjoner for H&E-farging og eventuelle ekstra immunhiistokjemiske flekker som kan være nødvendig. Send inn de fargede TMA-seksjonene for patologisk gjennomgang.

For TMA-validering bør patologen gjennomgå H&E-lysbildet fra TMA-blokken og gjennomgå hvert sirkulære sted under mikroskopet for å se om vevet av interesse er til stede. En kritisk komponent i byggeprosessen er identifisering av vev av interesse i en gitt donorblokk hvorfra TMA-kjernen skal oppnås. Den første kolonnen i denne figuren viser eksemplarisk donor H&Es med patologens markeringer.

Den andre kolonnen viser det stansede området av H&E farget vev. Den tredje kolonnen viser H&E farget vev av TMA-kjernene som ble høstet fra donorblokkene i områdene vist i kolonne en og to. Patologen kan se den matchede donorblokken og TMA-kjernen H&Es sammen for å validere at interesseområdet ble samlet inn og at vevssammensetningen er den samme.

Det er to prinsippmålinger for vellykket fullføring av en TMA ved hjelp av båndmetoden. Den første er tilstedeværelsen av vevskjerne prikker i forventede posisjoner og avstand bortsett fra hverandre, som vurderes ved visuell inspeksjon. Bildene som vises i A og B, viser to fullførte båndmetode-TMAer og de tilsvarende H&E-lysbildene.

Visuelle inspeksjoner av disse TMA-blokkene viser at kjernene er til stede og regelmessig fordelt i hver TMA og deres tilsvarende seksjoner. Noen av de viktigste konstruksjonsproblemene som kan oppstå under båndmetodekonstruksjonsprosessen inkluderer separasjon av blokken og kassetten på grunn av for tidlig fjerning av metallbasen før størkning, som vist i bilde C.Core-topping og / eller plasseringsdrift av de innebygde kjernene som vist i bilde D kan oppstå mens overdreven turbulent helling av smeltet paraffin, som kan forverres av dårlig limt dobbeltsidig pinnebånd. Denne figuren viser at H&E-flekken for hver av kjernene er en eksemplarisk TMA.

Alle unntatt ett av kjernepunktene er til stede i H&E. Figuren viser også at noen av kjernene er til stede som komplette sirkulære vevs prikker, mens andre ikke er helt til stede. Slike vevstap er ikke uvanlig og kan skyldes utilstrekkelig blokk som vender mot å avsløre alle kjerner i sin helhet.

Alternativt kan tilstedeværelsen av ufullstendig eller totalt fravær av vev stamme fra dårlig vevskvalitet av den kjernen, noe som kan føre til vevstap under fargingsprosessen. I denne neste figuren ble immunhiistokjemi og RNA ISH-farging utført på TMA-seksjonene for å validere TMA ytterligere. Som vist her, kan en rekke flekker brukes avhengig av vevet som brukes til å konstruere TMA.

Vimentin brukes som kvalitetskontroll. U6 er en indikator på RNA-kvalitet. EBER brukes til å fastslå EBV-statusen.

Og CD20 er en B-cellemarkør som angir tilstedeværelsen av B-celler. Dette er noen få flekker som kan brukes til å validere din TMA. Etter å ha sett denne videoen, bør du forstå hvordan du lager en vevmikroarray ved hjelp av båndmetoden og hvorfor TMAer er viktige tids- og ressursbesparende forskningsverktøy.

Du bør også forstå at TMA-konstruksjon ikke er en ideell prosess, og at fortsatt patologisk veiledning og gjennomgang er kritiske komponenter, ikke bare under byggeprosessen, men også for immunhiistokjemiske studier utført på TMA-seksjoner for å sikre at vevet av interesse faktisk er til stede i TMA-delen.

Summary

Explore More Videos