10.1K Views
•
12:03 min
•
June 10th, 2022
DOI :
June 10th, 2022
•0:05
Introduction
0:55
Pathology Review
4:11
Preparation for TMA Construction
5:36
Core Placement
6:34
Completing the TMA
7:37
Validating the TMA
8:24
Results
11:25
Conclusions
Transcript
Vävnadsmikroarrayen, eller TMA, är ett viktigt forskningsverktyg som monterar små exemplifierande bitar av vävnad som kallas vävnadskärnor från formalin-fixerade paraffininbäddade vävnadsblock, kallade givarblock, till ett enda paraffinblock. Tejpmetoden är en helt manuell konstruktionsmetod som inverterar byggprocessen genom att gjuta blocket runt upprättstående kärnor och är därmed kompatibel med icke-idealiska givarblock och använder billiga, allmänt tillgängliga handhållna vävnadsmikroarrayer för engångsbruk. Arbetsflödet i flera steg i denna process kommer att demonstreras av Lee Wisner och Dr.Brandon Larsen.
Ett av de viktigaste begreppen att komma ihåg när man konstruerar TMA-block är det faktum att vävnader i formalinfasta paraffininbäddade vävnadsblock faktiskt är tredimensionella strukturer. Vi har utvecklat en animation här för att förklara detta koncept. Vad du ser här är en animering som visar ett formalin-fixerat paraffininbäddat vävnadsblock som visar den tredimensionella karaktären hos den vävnaden i blocket.
Du kan se att vävnaden är synlig högst upp i blocket och det området är ganska stort. Om vi kunde ha röntgensyn, så att säga, och se genom blocket, skulle vi kanske se att vävnaden faktiskt inte är enhetligt formad djupare inom det blocket, nästan som ett isberg i havet, där det du ser på ytan kanske inte faktiskt representerar vad som finns nedanför. Inom det vävnadsblocket kan det finnas ytterligare vävnadsbitar som inte är synliga på ytan.
Det kan finnas områden med nekros eller vävnadsdöd i mitten av den vävnaden djupare ner. En patolog bör faktiskt granska den tvådimensionella sektionen från toppen av det vävnadsblocket och sedan kommentera den bilden för att visa de områden som innehåller vävnaden av intresse och exklusive nekros eller andra typer av vävnad som faktiskt inte är av intresse. För att underlätta korrekt kärnprovtagning av vävnaden bör patologen göra tre saker.
Först, med hjälp av en glidmarkeringspenna, kommer patologen att markera vävnaden av intresse på bilden så att andra vävnader kan undvikas. För det andra, om det finns områden inom det intresseområdet som bör undvikas, kan patologen använda samma markeringspenna för att utplåna de områden som inte bör provtas. Och slutligen, helst med en annan färg på pennan, bör patologen markera de områden som är idealiska inom intresseområdet för kärnprovtagning och TMA-konstruktion.
Det är viktigt att komma ihåg att när den processen är klar kan vävnadskompositionen förändras djupare inuti varifrån ett kärnprov erhålls och vi visar detta här i animationen, att kärnans placering kommer att bestämma kärnans sammansättning, som kommer att variera beroende på vävnadens djup och vad som finns i det blocket. Till exempel, här är den första kärnan som vi illustrerar att fånga en del av vävnaden i sin övre halva men djupare inom blocket finns det inte längre någon vävnad där den kärnan erhålls från, så endast paraffinvax har provtagits. Den andra kärnan som vi har illustrerat här har fångat vävnad längs hela sin längd eftersom vävnad är närvarande i hela djupet av det blocket på den platsen.
Den tredje kärnan har fångat en del av vävnaden och har sedan fångat en del paraffinvax i mitten där det inte fanns någon vävnad närvarande och sedan fångat lite mer vävnad i dess nedre ände där det fanns vävnad i den nedre delen av det blocket. När patologigranskningen är klar sammanställer du den slutliga listan över givarblock som ska användas i TMA-konstruktionen och skapar sedan en TMA-karta. TMA-kartan är en schematisk skissering där kärnorna kommer att ligga i den färdiga TMA och glidmonterade vävnadssektionerna skurna från den resulterande TMA.
För orienteringsändamål, se till att TMA-kartan undviker att placera kärnor i en jämn matris som en tre till tre eller fyra av fyra matris och innehåller minst en orienteringsmarkör. Eftersom tejpmetoden inverterar byggprocessen genom att hälla smält vax runt de inverterade kärnorna, kräver detta skapandet av en andra karta som kallas en konstruktionskarta som är en spegelbild av TMA-kartan. Konstruktionskartan visar var varje kärna måste placeras under byggnationen för att visas på rätt plats i den färdiga TMA.
När kartorna har skapats, förbered metall TMA-basformen. För att styra kärnplaceringen använder du ett pappersrutt galler för engångsbruk. Klipp ut det pappersrutiga gallret i storlek och fäst en bit dubbelband på baksidan av gallret.
Placera gallret och tejpa i metallbrickan och lägg till en andra bit dubbelband ovanpå gallret. Överlägg den patologigranstnade H&E-bilden på FFPE-vävnadsblocket som ska stansas och använd patologens markeringar för att identifiera var vävnadsblocket ska stansas. Använd en handhållen manuell kärnstans, engångsbruk eller återanvändbar, stansa FFPE-givarblocket i lämplig region.
Om du använder en återanvändbar kärnstans, se till att den rengörs före och efter varje vävnadsstans. Mata ut kärnan från kärnstansen. Använd en nålplockning för att placera den utkastade kärnan på hårkorset på det dubbelstickade tejptäckta gallret.
Se till att kärnan placeras på ett inverterat, upprätt sätt så att vävnadsänden av kärnan kommer i kontakt med tejpen och är på rätt plats som anges av konstruktionskartan. Upprepa tills alla givarblock är kärnade och kärnorna placeras på lämpliga positioner. När alla kärnor är på plats, märk en plastkassett och placera den ovanpå metallbasen som innehåller kärnorna.
Kärnans höjd bör inte överstiga metallbrickans djup eftersom höga kärnor kommer att lutas eller vältas när kassetten sätts på plats. Häll försiktigt smält paraffin genom kassetten i kärnfacket. Låt det smälta paraffinet rinna över för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor i TMA: s kropp.
Se till att paraffinet fylls till toppen av kassetten så att kassetten är inbäddad och ordentligt bunden till paraffinblocket när den har stelnat. Låt blocket svalna vid rumstemperatur i 30 minuter och flytta inte blocket under denna tid. Kyl blocket vid fyra grader Celsius i ytterligare 30 minuter för att stelna helt.
När den är helt inställd, separera försiktigt metallbasformen och ta bort dubbelstickstejpen från paraffinblocket. När TMA är konstruerad, använd en mikrotom för att sektionera den nya TMA. När blocket har mötts på lämpligt sätt, samla in vävnadssektioner med full ansikte.
Överför sektionerna till ett förvärmt vattenbad och glidmontera vävnadssektionerna. När det är torrt, skicka in representativa sektioner för H & E-färgning och eventuella ytterligare immunohistokemiska fläckar som kan krävas. Skicka in de färgade TMA-avsnitten för patologisk granskning.
För TMA-validering bör patologen granska H & E-bilden från TMA-blocket och granska varje cirkulär plats under mikroskopet för att se om vävnaden av intresse är närvarande. En kritisk komponent i byggprocessen är identifiering av vävnader av intresse i ett givet givarblock varifrån TMA-kärnan ska erhållas. Den första kolumnen i denna figur visar exemplifierande donator-H&Es med patologens markeringar.
Den andra kolumnen visar det stansade området för H &E-färgade vävnader. Den tredje kolumnen visar den H&E-färgade vävnaden hos TMA-kärnorna som skördades från givarblocken i de områden som visas i kolumn ett och två. Patologen kan tillsammans se det matchade givarblocket och TMA-kärnans H&Es för att validera att intresseområdet samlades in och att vävnadssammansättningen är densamma.
Det finns två principmått för framgångsrikt slutförande av en TMA med bandmetoden. Den första är närvaron av vävnadskärp prickar vid de förväntade positionerna och avståndet från varandra, vilket bedöms genom visuell inspektion. Bilderna som visas i A och B visar två framgångsrikt genomförda TMA för bandmetod och motsvarande H&E-bilder.
Visuella inspektioner av dessa TMA-block visar att kärnorna är närvarande och regelbundet åtskilda i varje TMA och deras motsvarande sektioner. Några av de viktigaste konstruktionsproblemen som kan uppstå under bandmetodens konstruktionsprocess inkluderar separation av blocket och kassetten på grund av för tidigt avlägsnande av metallbasen före stelning, vilket visas i bild C.Kärntippning och / eller placeringsdrift av de inbäddade kärnorna som visas i bild D kan uppstå medan alltför turbulent hällning av det smälta paraffinet, vilket kan förvärras av dåligt självhäftande dubbelsidig sticktejp. Denna figur visar att H&E-fläcken för var och en av kärnorna är en exemplarisk TMA.
Alla utom en av kärnplatserna finns i H&E. Figuren visar också att några av kärnorna är närvarande som kompletta cirkulära vävnadspärlar, medan andra inte är helt närvarande. Sådan vävnadsförlust är inte ovanlig och kan bero på otillräcklig blockvändning för att avslöja alla kärnor i sin helhet.
Alternativt kan närvaron av ofullständig eller total frånvaro av vävnad bero på dålig vävnadskvalitet hos den kärnan, vilket kan leda till vävnadsförlust under färgningsprocessen. I denna nästa figur utfördes immunohistokemi och RNA ISH-färgning på TMA-sektionerna för att ytterligare validera TMA. Som visas här kan en mängd olika fläckar användas beroende på vävnaden som används för att konstruera TMA.
Vimentin används som kvalitetskontroll. U6 är en indikator på RNA-kvalitet. EBER används för att bestämma EBV-statusen.
Och CD20 är en B-cellmarkör för att indikera närvaron av B-celler. Det här är några fläckar som kan användas för att validera din TMA. Efter att ha tittat på den här videon bör du förstå hur man gör en vävnadsmikroarray med tejpmetoden och varför TMA är viktiga tids- och resursbesparande forskningsverktyg.
Du bör också förstå att TMA-konstruktion inte är en idealisk process och att fortsatt patologisk vägledning och granskning är kritiska komponenter inte bara under byggprocessen utan också för immunohistokemiska studier utförda på TMA-sektioner för att säkerställa att vävnaden av intresse faktiskt finns i TMA-sektionen.
Detta protokoll beskriver tejpmetoden för hur man manuellt konstruerar en vävnadsmikroarray med FFPE-givarblock med olika djup.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved