Name: the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل قسم التكنولوجيا الحيوية (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 إلى SRGS)؛ مجلس بحوث العلوم والهندسة (CRG/2019/000281 إلى SRGS)؛ DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 إلى SRGS) وبرنامج شراكة IISc-DBT (إلى SRGS). تم دعم البنية التحتية في القسم من قبل DST-FIST و DBT و UGC. تم اعتماد AMB من قبل DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

يتضمن البروتوكول بذر الخلايا الصباغية متبوعا بتحول البلازميدات. وتشمل الخطوات الأخرى تثبيت الخلايا، والتتيح المناعي، والتصوير، وتحليلها لقياس طول وعدد ال REs. ويرد أدناه الوصف المفصل للبروتوكول.
1. بذر الخلايا الصباغية الماوس على coverlips المعالجة مسبقا
<ol><li>معطف cover...

<ol>
	<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+building+BLOC(k)s+of+lysosomes+and+related+organelles.">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport.">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li><li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes.">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+adaptor+protein+(AP)-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes.">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li><li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes.">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li><li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles.">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis.">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li><li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2,+AP-3,+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles.">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li><li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes.">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li><li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles.">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li><li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery.">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li><li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis.">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes.">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).</li><li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers.">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).</li><li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome:+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function.">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li><li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+lysosome-related+organelles:+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases.">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li><li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes.">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li><li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes.">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A.">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li><li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence.">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li><li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling.">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+at+the+recycling+endosome.">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li><li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+recycling+endosomes.">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li><li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes.">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li><li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system.">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li><li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+active:+protein+sorting+in+endocytic+recycling.">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li><li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling.">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li><li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin.">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li></ol>

إعادة تدوير الاندوسومات هي مجموعة من العضيات الانسطية، وأنها تتوسط في إعادة تدوير البضائع إلى سطح الخلية في جميع أنواع الخلايا21،22،23،24،25. في أنواع الخلايا المتخصصة مثل الخلايا الصباغية، تحول هذه ال?...

يحدث التمثيل الحيوي لأصباغ الميلانين في الميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسومات الخاصة بالخلايا الصباغية (LRO) تتعايش مع الليسوسومات التقليدية. يلعب النظام الإندوسيتيكي دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، المطلوبة للون البشرة وprotection ضد الإشعاع المؤين1،2،3. خلال هذه العملية، يتم فرز الإنزيمات توليف الميلانين على الاندوسومات في وقت مبكر / الفرز ومن ثم نقلها إلى الميلانوسومات المبكرة من خلال الاندوسومات أنبوبي أو المركبات تسمى إعادة تدوير الانسومات (REs)4،5،6،7،8،9،10. استهداف وانصهار هذه العضيات تنظيم نضوج الميلانوسومات المصطبغة تعمل بكامل طاقتها7،11،12،13،14. العيوب في تشكيل هذه العضيات أو فرز البضائع إلى هذه العضيات تسبب المهق oculocutaneous وغيرها من الأنماط الظاهرية السريرية، لوحظ في متلازمة هيرمانسكي بودلاك15،16.
هنا نصف تقنية بسيطة تعتمد على المجهر لدراسة وتحليل REs. في هذه الطريقة، لقد استفدنا من بروتين ترانسممبران، Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 الذي يقيم على إعادة تدوير endosomes17 ودورات بين الاندوسومات الفرز والميلانوسومات في الخلايا الصباغية12،18. علاوة على ذلك ، فإن حذف النطاق التنظيمي غير المنظم N-terminal (أي SynN أو STX13Δ129) يسمح لل SNARE بالتعثر في الميلانوسومات ، والذي يقيس مسار الاتجار إلى الأمام نحو الميلانوسوم12. لقد استخدمنا علامة إعادة تدوير نهايةوسومية معروفة Rab GTPase (Rab)11 في دراساتنا14,19. التصوير الفلوري للبروتينات GFP-STX13WT، GFP-STX13Δ129، mCherry-Rab11، و TYRP1 في الخلايا الصباغية البرية من النوع تليها تحديد كمي لتوطينها النسبي سيوفر طبيعة وديناميات REs بالإضافة إلى استهدافها للميلانوسومات. وهكذا، هذه تقنية بسيطة يمكن استخدامها لتصور وقياس ديناميات REs في الخلايا الصباغية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>022600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate-13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking

إعادة تدوير الاندوسومات (REs) هي العضيات الأنبوبية المركبات المتولدة من الإنسومات المبكرة / الفرز في جميع أنواع الخلايا. تلعب هذه العضيات دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسوم تنتجها الخلايا الصباغية. REs تسليم البضائع الخاصة بالخلايا الصباغية إلى الميلانوسومات المبكرة أثناء تشكيلها. انسداد في جيل REs، لوحظ في العديد من المسوخ من متلازمة هيرمانسكي بودلاك، يؤدي إلى نقص التصبغ من الجلد والشعر والعين. لذلك ، فإن دراسة ديناميكيات (الرجوع إلى عدد وطول) REs مفيدة لفهم وظيفة هذه العضيات في الظروف الطبيعية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى قياس ديناميات RE باستخدام STX13 SNARE المقيمين.

القياس الكمي لتوطين متحول STX13Δ129 إلى الميلانوسومات أظهر المجهر المناعي من STX13 في الخلايا الصباغية نوع الماوس البرية GFP-STX13WT المترجمة كهياكل المركبات والأنابيب وGFP-STX13Δ129 المترجمة كهياكل تشبه حلقة بالإضافة إلى سطح الخلية (الشكل 1A).<...

Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

إعادة تدوير الاندوسومات هي جزء من شبكة أنبوبية endosomal. هنا نقدم طريقة لقياس ديناميات إعادة تدوير الاندوسومات باستخدام GFP-STX13 كعلامة عضوية.

الفحص القائم على المجهر لدراسة وتحليل الإندوسومات المعاد تدويرها باستخدام الاتجار في SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

الفحص القائم على المجهر لدراسة وتحليل الاندوسومات المعاد تدويرها باستخدام الاتجار بالسونار. هذه هي الخلايا الصباغية الجلد. تسمى العضيات ذات اللون الأسود التي تراها داخل الخلايا الميلانوسومات.ومن المعروف الميلانوسومات كفئة من العضيات تسمى العضيات المرتبطة lysozome أو LRO. إعادة تدوير الاندوسومات هي العضيات المركبات أنبوبي من الاندوسومات في وقت مبكر أو الفرز في جميع أنواع الخلايا. هذه العضيات تلعب دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات، وهو العضيات المرتبطة lysozome التي تنتجها الخلايا الصباغية.إعادة تدوير الاندوسومات تسليم البضائع الخاصة بالخلايا الصباغية إلى الميلانوسومات المبكرة أثناء تشكيلها. جيل إعادة تدوير الاندوسومات التي لوحظت في العديد من المتلازمة هو خلايا في فرط تصبغ الجلد والشعر والعين. لذلك ، فإن دراسة ديناميكيات إعادة تدوير الاندوسومات مفيدة لفهم وظيفة هذه العضيات في الظروف الطبيعية والمرضية.تهدف هذه الدراسة إلى قياس ديناميكيات إندوسومز إعادة التدوير باستخدام اعتقال بناء الجملة SNARE-13. الخطوة الأولى هي بذر الخلايا الصباغية الماوس على coverlips المعالجة مسبقا. معطف يغطي الزجاج في طبق بيتري في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.وجففه في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. غسل الأغطية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X قبل الاستخدام. البذور الخلايا على غشاء الطابق السفلي يغطي المغلفة المتوسطة في كفاءة 50 إلى 60٪.أضف دائما 200 نانومولار من PMA إلى تعليق الخلية المطلية في وسائط RPMI كاملة. بعد بذر الخلايا، احتضان الطبق الذي يحتوي على خلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 24 ساعة. الخطوة الثانية هي نقل الخلايا مع syntaxin-13 البلازميدات.احتضان النصائح التي تحتوي على الحمض النووي وكشف العدوى، مزيج لمدة خمس دقائق وتخلط دون pipetting المتكررة. اضغط على الأنبوب باليد كل عشر دقائق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X، مرة واحدة باستخدام OPTI-MEM، ثم أضف 1 ميل من OPTI-MEM إلى الخلايا.بعد 30 دقيقة من الحضانة ، أضف مزيج الحمض النووي الكاشف للإصابة إلى الخلايا بطريقة قطرة حكيمة من خلال تغطية الطبق. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. يستنشق المتوسطة OPTI-MEM مع كاشف العدوى وإضافة المتوسطة RPMI كاملة تكملها مع 200 nanomolars من PMA.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. الخطوة الثالثة هي تثبيت الخلايا. يرجى ملاحظة أنه يتم تنفيذ الإجراء التالي خارج غطاء محرك الأنسجة.بعد 48 ساعة من العدوى، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 3٪ من الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني 1X وخزن الأغطية في برنامج تلفزيوني 1X حتى مزيد من الاستخدام. بدلا من ذلك، يمكن تركيب الخلايا على ألواح زجاجية أو تخزينها في أربع درجات مئوية.الخطوة الرابعة هي التأني المناعي للخلايا. إعداد غرفة رطبة. وضع قطع قطعة parafilm على ورقة تصفية الماوس في طبق بيتري.تغطية مع رقائق الألومنيوم. إعداد 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية. إضافة الأجسام المضادة في تخفيف من 1 إلى 200.إضافة هذا الحل كقطر على البارافيلم في غرفة رطبة. رفع بعناية coverlip مع ملقط. عكس ذلك على قطرة من الأجسام المضادة الأولية تلطيخ الحل، ومن ثم تغطية غطاء الغرفة الرطبة.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وبالمثل، إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في تخفيف من 1 إلى 500 ووضعه على parafilm بجوار غطاء في غرفة رطبة. لتلطيخ النواة، أضف DAPI في تخفيف من 120، 000 إلى 130، 000 إلى الحل.باستخدام ملقط، والتقاط بعناية coverslip من الحل الأساسي للأجسام المضادة وتراجع مرتين في برنامج تلفزيوني 1X. اضغط على غطاء على ورق الأنسجة لإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة على coverlip. وضعه على حل تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية في غرفة رطبة ولا يعرضها للضوء، وذلك بسبب وجود الأجسام المضادة مصبوغة الفلورسنت في الحل.بعد الحضانة ، التقط بعناية الغطاء من محلول الأجسام المضادة الثانوي ثم تراجعه مرتين في برنامج تلفزيوني 1X. علاوة على ذلك، اضغط على غطاء الغطاء على ورق الأنسجة لإزالة برنامج تلفزيوني الزائد على غطاء. ضع 12 ميكرولتر من كاشف التصوير على شريحة زجاجية وضع بعناية غطاء ملون على كاشف التركيب.عكس الشريحة الزجاجية على ورق الأنسجة ثم اضغط بلطف. بعد ذلك ، قم بتصوير الغطاء باستخدام مجهر مضان وتحليل الصور باستخدام ImageJ. الخطوة السادسة هي تحديد التداخل بين إعادة تدوير البروتينات المحلية والميلانوسومات.القياس الكمي لبناء الجملة-13 دلتا-129 كولوكاليشن مع الميلانوسومات. أظهر المجهر المناعي لبناء الجملة-13 في الخلايا الصباغية من النوع البري للفأر GFP-syntaxin-13 البرية من النوع المترجم كهياكل المركبات والأنابيب. وGFP-syntaxin-13 دلتا-129 يترجمة الهياكل مثل حلقة بالإضافة إلى سطح الخلية.علاوة على ذلك ، أظهرت حلقة داخل الخلية مثل GFP-syntaxin-13 delta-129 كولوكاليزم مع بروتين الميلانوسوم TYRP1 في الميلانوسومات المشرقة على شكل حقل. كما هو مبين من قبل، لوحظ مجموعة من نوع البرية GFP-syntaxin-13 مفرط التعبير في الميلانوسومات. لقياس التعريب النسبي للGFP-syntaxin-13 نوع البرية وGFP-syntaxin-13 دلتا-129 إلى الميلانوسومات، تم استخدام البرمجيات فيجي وتم تحليل مع البرنامج المساعد JACOP.معامل التداخل المقاس Mander، أي MOC، بين GFP-syntaxin-13 دلتا-129 مع TYRP1 هو تقريبا 1.5 أضعاف أعلى بالمقارنة مع نوع البرية GFP-syntaxin-13 مع TYRP1. ومن المثير للاهتمام، أظهرت TYRP1 2.9 أضعاف قيم MOC أعلى مع GFP-syntaxin-13 دلتا-129 مقارنة مع نوع البرية GFP-syntaxin-13. تشير هذه البيانات إلى أن توطين GFP-syntaxin-13 delta-129 melanosomes أعلى نسبيا مقارنة بنوع GFP-syntaxin-13 البري في حالة ثابتة.تحديد كمي لتعريب نوع بناء الجملة-13 البرية من الاندوسومات إعادة التدوير. أظهر المجهر المناعي من نوع GFP-syntaxin-13 البرية كولوكالينج مع البروتين الإندووسومي المعروف إعادة التدوير Rab11. و MOC بين GFP-syntaxin-13 نوع البرية مع mCherry-Rab11 هو ما يقرب من 1.4 أضعاف أعلى بالمقارنة مع mCherry-Rab11 مع GFP-syntaxin-13 نوع البرية.ولقياس عدد وطول الأنابيب الاندومالية الإيجابية من النوع البري GFP-syntaxin-13، استخدمت برمجيات فيجي على النحو المبين في قسم البروتوكول. يستخدم mCherry-Rab11 عنصر تحكم إيجابي في التجارب. وأظهرت الخلايا الصباغية التي تم تحويلها مع نوع البرية GFP-syntaxin-13 عددا أكبر من الأنابيب لكل خلية مقارنة مع الخلايا التي تعبر عن mCherry-Rab11.ومع ذلك، يتم تقليل الأنابيب عند التعبير المشترك لكل من نوع GFP-syntaxin-13 البرية و mCherry-Rab11 في الخلايا. الخطوة السابعة هي تحديد كمي لإعادة تدوير عدد الاندوسومات الأنبوبية وطولها. يتم تقليل الأنابيب عند التعبير المشترك لكل من نوع GFP-syntaxin-13 البري و mCherry-Rab11 في الخلايا.ومن المثير للاهتمام، متوسط طول أنبوبي من كل من نوع البرية GFP-syntaxin-13 و mCherry-Rab11 مماثلة لبعضها البعض في الخلايا التي تعبر بشكل فردي أو معا. معا، تشير هذه البيانات إلى أن نوع GFP-syntaxin-13 البرية يترجمة لإعادة تدوير الاندوسومات على غرار Rab11. وأظهرت هذه الدراسة أن تسليم N-المحطة الطرفية من syntaxin-13 متحولة، وهذا هو GFP-syntaxin-13 دلتا-129، يحط إلى الميلانوسومات GFP-syntaxin-13 دلتا-129 يمكن أن تستخدم ربما كمراسل للاتجار المركبات من إعادة تدوير الاندوسومات إلى سطح الخلية وLRO.في المقابل، نوع البرية GFP-syntaxin-13 ي محلية لإعادة تدوير الاندوسومات مماثلة ل Rab11. أوضحت هذه الدراسة أنه يمكن أيضا استخدام نوع GFP-syntaxin-13 البري لوضع علامات على إعادة تدوير الاندوسومات في الخلايا الصباغية. قد يكون نوع GFP-syntaxin-13 البري علامة endosomal إعادة تدوير أفضل من Rab11 ، نظرا لأن Rab11 يغير ديناميكيات الاندوسومال.كل ذلك معا، GFP-syntaxin-13 نوع البرية يعمل علامة إعادة التدوير endosomal المحتملة لدراسة ديناميات في ظروف الحالة الثابتة.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

في دراسة لالإلتقام وإعادة غشاء البلازما من البروتينات القائم على خلية L-الجلوتاثيون حماية فحوصات

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...