Name: the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 ל-SRGS); ועדת מחקר מדע והנדסה (CRG/2019/000281 ל-SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 ל-SRGS) ותוכנית השותפות IISc-DBT (ל-SRGS). התשתית במחלקה נתמכה על ידי DST-FIST, DBT ו- UGC. AMB נתמך על ידי DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

הפרוטוקול כרוך זריעת מלנוציטים ואחריו טרנספקטו של plasmids. צעדים נוספים כוללים קיבעון, חיסונים, הדמיה וניתוח של התאים כדי למדוד את האורך והמספר של REs. התיאור המפורט של הפרוטוקול ניתן להלן.
1. זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש
<ol><li>מצפים את כיסויי הזכוכי?...

<ol>
	<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+building+BLOC(k)s+of+lysosomes+and+related+organelles.">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport.">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li><li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes.">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+adaptor+protein+(AP)-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes.">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li><li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes.">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li><li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles.">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis.">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li><li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2,+AP-3,+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles.">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li><li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes.">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li><li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles.">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li><li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery.">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li><li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis.">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes.">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).</li><li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers.">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).</li><li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome:+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function.">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li><li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+lysosome-related+organelles:+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases.">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li><li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes.">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li><li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes.">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A.">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li><li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence.">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li><li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling.">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+at+the+recycling+endosome.">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li><li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+recycling+endosomes.">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li><li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes.">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li><li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system.">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li><li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+active:+protein+sorting+in+endocytic+recycling.">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li><li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling.">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li><li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin.">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li></ol>

מיחזור אנדוזומים הם קבוצה של אברונים אנדוציטיים, והם מתווכים את מיחזור המטען למשטח התא בכל סוגי התאים21,22,23,24,25. בסוגי תאים מיוחדים כגון מלנוציטים, אברונים אלה מסיטים חלקית את נתיב הסחר שלהם לכיוון המל...

ביוסינטזה של פיגמנטים מלנין מתרחשת מלנוזומים, אברון ספציפי מלנוציטים (LRO) כי קיים יחד עם ליזוזומים קונבנציונליים. המערכת האנדוציטית ממלאת תפקיד מרכזי בביוגנזה של מלנוזומים, הנדרשת לצבע עור והגנה פוטו-הגנתית מפני קרינה מייננת1,2,3. במהלך תהליך זה, אנזימי סינתזה מלנין ממוינים על אנדוזומים מוקדמים / מיון ולאחר מכן מועברים מלנוזומים מוקדמים באמצעות אנדוזומים צינוריים או אופניים הנקראים אנדוזומים מיחזור (REs)4,5,6,7,8,9,10. פילוח והיתוך של אברונים אלה לווסת את ההתבגרות של מלנומוזומים פיגמנטיים פונקציונליים לחלוטין7,11,12,13,14. פגמים בהיווצרות של אברונים אלה או מיון מטען לאברונים אלה גורמים לבקנות oculocutaneous ופנוטיפים קליניים אחרים, שנצפו תסמונת הרמנסקי-Pudlak15,16.
כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופיה כדי ללמוד ולנתח את REs. בשיטה זו, ניצלנו חלבון transmembrane, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 התב"ע המונה על מיחזור אנדוזומים17 ומחזורים בין מיון אנדוזומים ומלנוזומים במלנוציטים12,18. יתר על כן, מחיקה של N-terminal לא מובנה דומיין רגולטורי (כלומר SynN או STX13Δ129) מאפשרת SNARE להיתקע melanosomes, אשר מודד את מסלול הסחר קדימה לכיוון melanosome12. השתמשנו בסמן אנדוסומאלי ידוע מיחזור Rab GTPase (Rab)11 במחקרים שלנו14,19. הדמיית פלואורסצנטיות של החלבונים GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ו- TYRP1 במלנוציטים מסוג בר ואחריו כימות הלוקליזציה היחסית שלהם תספק את הטבע והדינמיקה של REs בנוסף למיקודם למלנוזומים. לכן, זוהי טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לדמיין ולמדוד את הדינמיקה של REs במלנוציטים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>022600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate-13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking

מיחזור אנדוזומים (REs) הם אברונים צינוריים-ארסיים שנוצרו מאנדוזומים מוקדמים /מיון בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים. REs לספק את המטען ספציפי מלנוציט למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. חסימה בדור של REs, נצפתה במספר מוטציות של תסמונת הרמנסקי-Pudlak, גורמת hypopigmentation של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה (מתייחס למספר ולאורך) של REs שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות. במחקר זה, אנו שואפים למדוד את הדינמיקה RE באמצעות תושב SNARE STX13.

כימות של לוקליזציה מוטנטית STX13Δ129 למלנוזומים מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של STX13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-STX13WT מקומי כמבנים ריסקוליים וצינוריים ו- GFP-STX13Δ129 המותאמים לשפות מקומיים כמבנים דמויי טבעת בנוסף למשטח התא (איור 1A).</...

Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

המיקרוסקופיה מבוססת על בדיקות כדי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE. אלה מלנוציטים מעור. האברונים בצבע שחור שרואים בתוך התאים נקראים מלנומוזומים.מלנוזומים ידועים כמעמד של אברונים הנקראים אברונים הקשורים לליזוזום או LRO. מיחזור אנדוזומים הם אברונים אופניים צינוריים מתחילת או מיון אנדוזומים בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים.אנדוזומים למיחזור מספקים את המטען הספציפי למלנוציטים למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. הדור של אנדוזומים מיחזור שנצפו במספר תסמונות הוא תאים היפרפיגמנטציה של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות.מחקר זה נועד למדוד את הדינמיקה של אנדוזומים מיחזור באמצעות עצירת תחביר SNARE-13. הצעד הראשון הוא זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש. מצפים את כיסויי הזכוכית בצלחת פטרי במדיום מטריצת הממברנה במרתף.ולייבש אותו במכסה המנוע תרבית הרקמות במשך 15 דקות. יש לשטוף את כיסויי הכיסוי פעם אחת עם 1X PBS לפני השימוש. זרע את התאים על קרום המרתף כיסויים מצופים בינוניים ב 50 עד 60% כשירות.תמיד להוסיף 200 nanomolars של PMA השעיית תא מצופה במדיה RPMI מלאה. לאחר זריעת התאים, לדגור על המנה המכילה תאים באינקובטור CO2 במשך 12 עד 24 שעות. השלב השני הוא טרנספקטציה של תאים עם תחביר-13 פלסמידים.לדגור על הטיפים המכילים DNA ריאגנט transfection, לערבב במשך חמש דקות ומערבבים ללא pipetting חוזר. הקש על הצינור ביד כל עשר דקות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS, פעם אחת עם OPTI-MEM, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליון של OPTI-MEM לתאים.לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף את תערובת DNA ריאגנט transfection לתאים בצורה טיפה חכם על ידי כיסוי המנה. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. שאפו את המדיום OPTI-MEM עם ריאגנט transfection ולהוסיף מדיום RPMI מלא בתוספת 200 nanomolars של PMA.לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. השלב השלישי הוא קיבעון התאים. אנא שימו לב כי ההליך הבא מתבצע מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמות.לאחר 48 שעות של טרנספקטציה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3%פורמלדהיד במשך 30 דקות. לאחר קיבעון, לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS ולאחסן את כיסויים ב 1X PBS עד לשימוש נוסף. לחלופין, תאים יכולים להיות מותקנים על לוחות זכוכית או מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס.השלב הרביעי הוא חיסון התאים. הכן תא לח. מניחים חתיכת חיתוך פרפילם על נייר מסנן עכברים בצלחת פטרי.מכסים בנייר אלומיניום. הכן 25 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים העיקרי. הוסף נוגדן בדילול של אחד עד 200.הוסף פתרון זה כטיפה על parafilm בתא לח. הרימו בזהירות את כיסוי המכסה במלקחיים. הפוך אותו על טיפה של פתרון כתמי נוגדנים ראשוניים, ולאחר מכן לכסות את המכסה של התא לח.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. באופן דומה, להכין את פתרון הנוגדנים המשני בדילול של אחד עד 500 ולהניח אותו על parafilm ליד כיסוי בתא לח. להכתמת הגרעין, הוסף DAPI בדילול של 120, 000 עד 130,000 לפתרון.בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים העיקרית וטבלו אותו פעמיים ב-PBS 1X. הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים אותו על תמיסת כתמי הנוגדנים המשנית בתא הלח ואינם חושפים אותו לאור, בשל נוכחותם של נוגדנים צבועים פלואורסצנטית בתמיסה.לאחר הדגירה, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים המשנית ולאחר מכן טובלים אותו פעמיים ב- PBS 1X. יתר על כן, הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים 12 מיקרוליטרים של ריאגנט הדמיה על מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את כיסוי הויטראז' על ריאגנט הרכבה.הפוך את שקופית הזכוכית על נייר הטישו ולאחר מכן לחץ בעדינות. לאחר מכן, צלם את כיסוי הכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנתח את התמונות באמצעות ImageJ. השלב השישי הוא כימות החפיפה בין המיחזור חלבונים מקומיים אנדוזומים ומלנוזומים.כימות תחביר-13 דלתא-129 colocalization עם מלנוסומים. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של syntaxin-13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-syntaxin-13 מסוג בר לוקליזציה כמבנים ארסקולריים וצינוריים. ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 לוקליזציה של מבנים דמויי טבעת בנוסף לפני השטח של התא.יתר על כן, טבעת תאית דמוית GFP-syntaxin-13 דלתא-129 הראה colocalization עם חלבון מלנום TYRP1 במלנוזומים בתמונה שדה בהירה. כפי שמוצג קודם לכן, קבוצה של סוג בר GFP-syntaxin-13 בביטוי יתר נצפתה במלנוסומים. כדי למדוד את הלוקליזציה היחסית של סוג כללי של תחביר-13 ו- GFP-syntaxin-13 delta-129 למלנוזומים, נעשה שימוש בתוכנת פיג'י וניתוח נעשה עם תוסף JACOP.מקדם החפיפה של מנדר הנמדד, כלומר MOC, בין GFP-syntaxin-13 delta-129 עם TYRP1 גבוה בכ-1.5 לעומת סוג פראי GFP-syntaxin-13 עם TYRP1. מעניין, TYRP1 הראה 2.9 מקפלים ערכי MOC גבוהים יותר עם GFP-syntaxin-13 delta-129 בהשוואה לסוג פראי GFP-syntaxin-13. נתונים אלה מצביעים על כך שהלוקליזציה של מלנומוזומים דלתא-129 של GFP-syntaxin-13 גבוהה יחסית לסוג הבר GFP-syntaxin-13 במצב יציב.כימות של לוקליזציה מסוג בר של תחביר-13 של אנדוזומים למיחזור. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של סוג בר GFP-syntaxin-13 הראתה colocalization עם חלבון אנדוסומאלי מיחזור ידוע Rab11. ה- MOC בין סוג הפרא GFP-syntaxin-13 עם mCherry-Rab11 גבוה בכ-1.4 לעומת mCherry-Rab11 עם סוג פראי GFP-syntaxin-13.כדי למדוד את המספר והאורך של GFP-syntaxin-13 סוג פראי טוביות אנדוסומליות חיוביות, תוכנת פיג'י שימשה כמתואר בסעיף הפרוטוקול. mCherry-Rab11 משמש שליטה חיובית בניסויים. מלנוציטים שהודבקו בסוג בר GFP-syntaxin-13 הראו מספר גבוה יותר של צינורות לתא בהשוואה לתאים המבטאים mCherry-Rab11.עם זאת, הצינורות מצטמצמים על שיתוף פעולה של סוג בר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים. השלב השביעי הוא כימות המספר והאורך הצינוריים של אנדוזומים. הצינורות מצטמצמים על דו-קיום של סוג הבר GFP-syntaxin-13 ו mCherry-Rab11 בתאים.מעניין, אורך הצינור הממוצע הן מסוג GFP-syntaxin-13 והן mCherry-Rab11 דומה זה לזה בתאים המבטאים בנפרד או יחד. יחד, נתונים אלה מראים כי GFP-syntaxin-13 סוג בר לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה הראה כי משלוח N-מסוף של מוטציה syntaxin-13, כלומר GFP-syntaxin-13 דלתא-129, לוקליזציה למלנוזום GFP-syntaxin-13 דלתא-129 יכול לשמש ככתב לסחר ברכבים ממחזור אנדוזומים אל פני התא ו- LRO.לעומת זאת, סוג בר GFP-syntaxin-13 לוקליזציה למיחזור אנדוזומים דומים Rab11. מחקר זה המחיש כי סוג בר GFP-syntaxin-13 יכול לשמש גם לסימון אנדוזומים מיחזור במלנוציטים. סוג פראי GFP-syntaxin-13 עשוי להיות סמן אנדוסומאלי מיחזור טוב יותר מאשר Rab11, שכן Rab11 משנה את הדינמיקה האנדוסומית.בסך הכל, סוג הבר GFP-syntaxin-13 פועל סמן אנדוסומאלי מיחזור פוטנציאלי כדי ללמוד את הדינמיקה בתנאי מצב יציבים.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...