Name: the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00
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この作業は、バイオテクノロジー省(BT/PR32489/BRB/10/1786/2019からSRGS)によって支えられた。理工学研究委員会(CRG/2019/000281 SRGS)DBT-NBACD(BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20からSRGS)とIISc-DBTパートナーシッププログラム(SRGSへ)。この部門のインフラストラクチャは、DST-FIST、DBT、および UGC によってサポートされていました。AMB は DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02) によってサポートされました。

プロトコルは、プラスミドのトランスフェクションに続いてメラノサイトの播種を伴う。さらにステップには、細胞の固定、免疫染色、イメージング、および分析が含まれ、レの長さと数を測定する。プロトコルの詳細な説明は以下の通りです。
1. 前処理されたカバーリップ上のマウスメラノサイトの播種
<ol><li>ガラスカバーリップをペトリ皿(すなわち、...

<ol>
	<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+building+BLOC(k)s+of+lysosomes+and+related+organelles.">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport.">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li><li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes.">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+adaptor+protein+(AP)-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes.">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li><li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes.">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li><li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles.">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis.">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li><li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2,+AP-3,+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles.">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li><li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes.">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li><li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles.">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li><li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery.">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li><li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis.">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes.">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).</li><li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers.">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).</li><li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome:+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function.">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li><li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+lysosome-related+organelles:+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases.">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li><li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes.">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li><li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes.">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A.">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li><li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence.">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li><li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling.">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+at+the+recycling+endosome.">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li><li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+recycling+endosomes.">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li><li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes.">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li><li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system.">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li><li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+active:+protein+sorting+in+endocytic+recycling.">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li><li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling.">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li><li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin.">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li></ol>

エンドソームのリサイクルは、エンドサイトオルガネラのコホートであり、全ての細胞型で細胞表面への貨物のリサイクルを仲介します21,22,23,24,25。メラノサイトなどの特殊な細胞型では、これらのオルガネラは、その生物形成のためのメラノソームに向かって彼らの人...

メラニン色素の生合成は、メラノソーム、従来のリソソームと共存するメラノサイト特異的リソソーガネラ(LRO)で起こる。エンドサイト系は、色素体の生物形成において重要な役割を果たし、放射線電離放射線に対する皮膚色と光保護に必要な1,2,3です。この過程で、メラニン合成酵素は早期/選別エンドーソームで選別され、その後、循環性エンドーソーム(RE)4,5,6,7,8,9,10と呼ばれる管状または小胞性子宮体を介して早期メラノソームに輸送されます。これらのオルガネラの標的化および融合は、完全に機能性色素性メラノソーム7,11,12,13,14の成熟を調節する。これらのオルガネラまたはこれらのオルガネラへの貨物選別の形成における欠陥は、オキュロチュネアアルビニズムおよび他の臨床表現型を引き起こし、ヘルマンスキー・プドラク症候群15,16で観察された。
ここでは、Rを研究し、分析するための単純な顕微鏡ベースの手法について説明します。この方法では、endoソーム17のリサイクルに存在する膜貫通タンパク質であるQa-SNAREシンコシンシン(STX)13と、メラノサイトにおけるエンドーソームとメラノソーム間のサイクルを利用しています12,18。また、N末端非構造化制御ドメイン(すなわちSynNまたはSTX13Δ129)を削除すると、SNAREはメラノソームに立ち往生し、メラノソーム12に向かう前方の入稿経路を測定する。私たちの研究では、既知の循環型内経マーカーRab GTPase(Rab)11を使用しています14,19。タンパク質GFP-STX13WT、GFP-STX13Δ129、mCherry-Rab11、およびIRP1のタンパク質の蛍光イメージングは、その後、それらの相対的な局在化の定量化に続いて、メラノソームへの標的化に加えて、REの性質とダイナミクスを提供する。このように、これはメラノサイトのRのダイナミクスを可視化し、測定するために使用できる簡単な技術です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>022600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate-13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking

循環性の子宮体(R)は、すべての細胞タイプの早期/選別用の子宮間から生成される管状小胞性小器官である。これらのオルガネラは、メラノサイトによって産生されるリソソーム関連小器官であるメラノソームの生物形成において重要な役割を果たす。Rは、メラノサイト特有の貨物を形成中に早期メラノソームに提供します。レスキー・プドラック症候群のいくつかの変異体で観察される、レージの生成における閉塞は、皮膚、髪、および眼の色素沈着をもたらす。したがって、レジェのダイナミクス(数と長さを参照)を研究することは、正常および疾患状態におけるこれらのオルガネラの機能を理解するのに有用である。本研究では、居住SNARE STX13を用いてREダイナミクスを測定することを目指す。

STX13Δ129変異体のメラノソームへの定量化 マウス野生型メラノサイトにおけるSTX13の免疫蛍光顕微鏡検査は、GFP-STX13WTを細胞表面に加えて環状構造として局在した小胞および管状構造として局在し、GFP-STX133WTを示した(図1A)。また、細胞内リング様GFP-STX13Δ129は、メラノソームタンパク質のTYRP1(<strong class="xfig...

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The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

子宮内膜のリサイクルは、内膜管状ネットワークの一部です。ここでは、GFP-STX13をオルガネラマーカーとして使用して、エンドーソームのリサイクルのダイナミクスを定量化する方法を紹介します。

SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

SNAREの人身売買を用いたリサイクル用の子宮体を研究し、分析するための顕微鏡ベースのアッセイ。これらは皮膚メラノサイトです。細胞の中に見える黒い色のオルガネラはメラノソームと呼ばれます。メラノソームはリソゾーム関連小器官またはLROと呼ばれるオルガネラのクラスとして知られています。循環性の循環は、初期の尿細管状小胞小器官であり、すべての細胞タイプの中で子宮内ソームを選別する。これらのオルガネラはメラノソームの生物形成において重要な役割を果たす, メラノサイトによって生成されるリゾゾーム関連小器官.エンドーソームのリサイクルは、メラノサイト特有の貨物を形成中に早期のメラノソームに送達します。いくつかの症候群で観察される循環性の増殖性の生成は、皮膚、髪、および眼の色素沈着の細胞である。したがって、子宮体をリサイクルするダイナミクスを研究することは、正常および疾患状態におけるこれらのオルガネラの機能を理解するのに有用である。本研究は、逮捕SNARE構文-13を用いて、循環型の内ソームのダイナミクスを測定することを目的としている。最初のステップは、前処理されたカバーリップ上のマウスメラノサイトの播種です。基質膜マトリックス媒体でペトリ皿にガラスカバーリップをコーティングします。そして、ティッシュ培養フードで15分間乾燥させます。使用前に1X PBSでカバーリップを1回洗ってください。50〜60%のコンピテンシーで基部膜媒体コーティングカバーリップ上の細胞を播種します。完全なRPMI培地で、常に200ナノモルのPMAをメッキ細胞懸濁液に添加してください。細胞を播種した後、CO2インキュベーターに細胞を含む皿を12〜24時間インキュベートする。第2のステップは、シンサクシン-13プラスミドを有する細胞のトランスフェクションである。DNAとトランスフェクション試薬を含む先端をインキュベートし、5分間混合し、ピペット処理を繰り返さずに混合します。室温で30分間、10分おきに手でチューブをタップします。インキュベーション中に、細胞を1X PBSで2回、OPTI-MEMで1回洗浄し、細胞に1マイルのOPTI-MEMを加えます。インキュベーションのポスト30分、トランスフェクション試薬DNAを滴下して皿を覆って細胞に加える。細胞を摂氏37度で6時間インキュベートします。トランスフェクション試薬でOPTI-MEM培地を吸引し、PMAの200ナノモルを添加した完全なRPMI培地を添加する。48時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。第3のステップは、細胞の固定です。以下の手順は、組織培養フードの外側で行われます。48時間のトランスフェクションの後、1X PBSで細胞を2回洗浄し、3%ホルムアルデヒドで30分間細胞を固定します。固定後、細胞を1X PBSで2回洗浄し、さらに使用するまでカバーリップを1X PBSに保管します。あるいは、細胞をガラス板に取り付けたり、摂氏4度で貯蔵したりすることもできます。第4のステップは、細胞の免疫染色である。湿気の多いチャンバーを準備します。ペトリ皿のマウスフィルター紙にパラフィルムカットピースを置きます。アルミホイルで覆います。25マイクロリットルの一次抗体溶液を調製します。1~200の希釈で抗体を追加します。湿気の多いチャンバーのパラフィルムにドロップとしてこのソリューションを追加します。慎重に鉗子でカバースリップを持ち上げます。一次抗体染色液の滴下でそれを反転し、次に湿気の多いチャンバーの蓋を覆う。室温で30分間インキュベートします。同様に、二次抗体溶液を1~500の希釈で調製し、湿気の多いチャンバーのカバースリップの隣のパラフィルムに置きます。核を染色する場合は、溶液に120,000~130,000の希釈でDAPIを加えます。鉗子を使用して、慎重に一次抗体溶液からカバースリップをピックアップし、1X PBSに2回浸します。ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップの余分なPBSを取り除きます。二次抗体染色液を湿気の多いチャンバーに置き、溶液中に蛍光染色抗体が存在するため、光にさらしません。インキュベーション後、二次抗体溶液からカバースリップを慎重に取り出し、1X PBSに2回浸します。さらに、ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップ上の余分なPBSを取り除きます。12マイクロリットルのイメージング試薬をガラススライドに置き、染色カバースリップを取り付け試薬に慎重に置きます。ティッシュペーパーのガラススライドを反転させ、軽く押します。次に、蛍光顕微鏡を用いてカバースリップを画像化し、ImageJを用いて画像を解析する。第六ステップは、循環性の内在性タンパク質とメラノソームの間の重複の定量です。メラノソームとのシンサクシン-13 delta-129の共局化の定量化。マウス野生型メラノサイトにおけるシンコシン-13の免疫蛍光顕微鏡は、小胞および管状構造として局在するGFP-syntaxin-13野生型を示した。GFP-syntaxin-13 delta-129は、細胞表面に加えてリング状の構造を局所化します。また、細胞内環様GFP-syntaxin-13 delta-129は、明るい視野画像メラノソームにおけるメラノソームタンパク質TYRP1との共局在化を示した。前に示したように、過剰発現GFP-syntaxin-13野生型のコホートはメラノソームで観察される。GFP-syntaxin-13野生型とGFP-syntaxin-13 delta-129をメラノソームに対して相対的に局在化するために、フィジーのソフトウェアを使用し、JACOPプラグインで分析を行いました。測定されたマンダーのオーバーラップ係数、すなわちMOCは、TYRP1を有するGFP-syntaxin-13デルタ-129の間で、TYRP1のGFP-syntaxin-13野生型と比較して約1.5倍高い。興味深いことに、TYRP1はGFP-シンタックス13の野生型と比較してGFP-syntaxin-13 delta-129で2.9倍高いMOC値を示した。これらのデータは、GFP-syntaxin-13 delta-129メラノソームの局在化が、安定状態でのGFP-syntaxin-13野生型と比較して比較的高いことを示している。リサイクルエンドーソームのシンセクシン-13野生型の局在化の定量化。GFP-シンセニン-13野生型の免疫蛍光顕微鏡は、既知の循環型の内皮タンパク質Rab11と共局在化を示した。mCherry-Rab11を持つGFP-シンセニン-13野生型の間のMOCは、GFP-syntaxin-13野生型のmCherry-Rab11と比較して約1.4倍高い。GFP-syntaxin-13野生型正の内皮細管の数と長さを測定するために、フィジーのソフトウェアはプロトコルセクションで説明されているように使用されました。mCherry-Rab11は実験において陽性対照を用いる。GFP-syntaxin-13野生型にトランスフェクトしたメラノサイトは、mCherry-Rab11を発現する細胞と比較して、細胞当たりの細管数が多いことを示した。しかし、細胞内のGFP-シンセニン-13野生型とmCherry-Rab11の両方の共発現時に細管が減少する。第7のステップは、エンドソームの管内数と長さのリサイクルの定量化です。この尿細管は、細胞内のGFP-シンタックス13型とmCherry-Rab11の両方を共発現させると減少する。興味深いことに、GFP-シンタックス-13野生型およびmCherry-Rab11の両方からの平均細管長は、個別または一緒に発現する細胞において互いに匹敵する。これらのデータを組み合わせることで、GFP-syntaxin-13野生型はRab11と同様に内性体をリサイクルするために局所化することを示唆している。この研究は、GFP-syntaxin-13 delta-129であるシンシン13突然変異体のN末端送達は、培養物を細胞表面およびLROにリサイクルすることから、小胞性密売にレポーターとして使用できる可能性のあるメラノソームGFP-syntaxin-13 delta-129に局地化することを示した。一方、GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11と同様に、エンドーソームのリサイクルに局部的に対応しています。この研究は、GFP-syntaxin-13野生型がメラノサイトの内無代性のリサイクル性をマーキングするためにも使用できることを示した。GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11が内皮ダイナミクスを変化させるので、Rab11よりも優れた内皮マーカーをリサイクルする可能性があります。GFP-syntaxin-13野生型は、一緒に、定常状態のダイナミクスを研究するために潜在的な循環性内皮マーカーを作用させる。

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JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Computer-Generated Animal Model Stimuli

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...