Name: the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

Detta arbete stöddes av institutionen för bioteknik (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 till SRGS); Vetenskaps- och ingenjörsforskningsnämnden (CRG/2019/000281 till SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 till SRGS) och IISc-DBT partnerskapsprogram (till SRGS). Infrastruktur i avdelningen stöddes av DST-FIST, DBT och UGC. AMB stöddes av DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

Protokollet innebär sådd av melanocyter följt av transfektion av plasmiderna. Ytterligare steg inkluderar fixering, immunstaining, avbildning och analys av cellerna för att mäta längden och antalet REs. Den detaljerade beskrivningen av protokollet ges nedan.
1. Sådd av musmelanocyter på förbehandlade täcken
<ol><li>Täck glasöverdraget i en Petriskål (dvs. 4 - 5 i en 35 mm skål) med källarmembranmatrismedium (1:20 i komplett RPMI-medium: RPMI + 10% värme inakt...

<ol>
	<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+building+BLOC(k)s+of+lysosomes+and+related+organelles.">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport.">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li><li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes.">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+adaptor+protein+(AP)-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes.">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li><li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes.">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li><li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles.">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis.">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li><li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2,+AP-3,+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles.">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li><li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes.">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li><li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles.">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li><li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery.">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li><li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis.">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes.">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).</li><li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers.">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).</li><li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome:+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function.">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li><li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+lysosome-related+organelles:+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases.">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li><li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes.">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li><li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes.">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A.">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li><li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence.">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li><li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling.">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+at+the+recycling+endosome.">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li><li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+recycling+endosomes.">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li><li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes.">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li><li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system.">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li><li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+active:+protein+sorting+in+endocytic+recycling.">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li><li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling.">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li><li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin.">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li></ol>

Återvinningsendosomer är en kohort av endocytiska organeller, och de förmedlar återvinning av last till cellytan i alla celltyper21,22,23,24,25. I specialiserade celltyper som melanocyter avleder dessa organeller delvis sin smugglingsväg mot melanosomerna för deras biogenes3,16,26.<sup...

Biosyntes av melanin pigment förekommer i melanosomer, en melanocyt-specifika lysosome-relaterade organelle (LRO) som samexisterar med konventionella lysosomer. Det endocytiska systemet spelar en nyckelroll i biogenesen av melanosomer, som krävs för hudfärg och fotoskydd mot joniserande strålning1,2,3. Under denna process sorteras melaninsynteserande enzymer på tidiga / sorteringsendosomer och transporteras sedan till för tidiga melanosomer genom tubulära eller vesikulära endosomer som kallas återvinning endosomer (REs)4,5,6,7,8,9,10. Inriktningen och fusionen av dessa organeller reglerar mognaden av fullt fungerande pigmenterade melanosomer7,11,12,13,14. Defekter i bildandet av dessa organeller eller lastsortering till dessa organeller orsakar oculocutaneous albinism och andra kliniska fenotyper, observerade i Hermansky-Pudlak syndrom15,16.
Här beskriver vi en enkel mikroskopibaserad teknik för att studera och analysera REs. I denna metod har vi utnyttjat ett transmembranprotein, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 som finns på återvinning endosomer17 och cyklar mellan sortering av endosomer och melanosomer i melanocyter12,18. Dessutom gör radering av N-terminal ostrukturerad regleringsdomän (nämligen SynN eller STX13Δ129) det möjligt för SNARE att fastna i melanosomer, som mäter den framåtriktade människohandelsvägen mot melanosom12. Vi har använt en känd återvinning endosomal markör Rab GTPase (Rab)11 i våra studier14,19. Fluorescensavbildning av proteinerna GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 och TYRP1 i melanocyter av vild typ följt av kvantifiering av deras relativa lokalisering kommer att ge arten och dynamiken hos REs utöver deras inriktning på melanosomer. Således är detta en enkel teknik som kan användas för att visualisera och mäta dynamiken hos REs i melanocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>022600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate-13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking

Återvinning endosomer (REs) är tubular-vesicular organeller som genereras från tidiga /sortering endosomes i alla celltyper. Dessa organeller spelar en nyckelroll i biogenesen av melanosomer, en lysosomrelaterad organell producerad av melanocyter. REs levererar den melanocytspecifika lasten till för tidiga melanosomer under bildandet. Blockering i generering av REs, observeras i flera mutanter av Hermansky-Pudlak syndrom, resulterar i hypopigmentation av hud, hår och öga. Därför är det användbart att studera dynamiken (se antal och längd) av REs för att förstå funktionen hos dessa organeller under normala och sjukdomsförhållanden. I denna studie strävar vi efter att mäta RE-dynamiken med hjälp av en resident SNARE STX13.

Kvantifiering av STX13Δ129 mutant lokalisering till melanosomerna Immunofluorescensmikroskopi av STX13 i mus vilda typ melanocyter visade GFP-STX13WT lokaliseras som vesicular och rörformiga strukturer och GFP-STX13Δ129 lokaliseras som ring-liknande strukturer utöver cellytan (figur 1A). Vidare visade intracellulära ring-liknande GFP-STX13Δ129 colocalization med melanosome protein TYRP1 (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Återvinningsendosomer är en del av det endosomala rörnätet. Här presenterar vi en metod för att kvantifiera dynamiken i återvinning endosomer med GFP-STX13 som organellmarkör.

Den mikroskopibaserade analysen för att studera och analysera återvinningsdosomerna med hjälp av SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

Den mikroskopibaserade analysen för att studera och analysera återvinningsdosomerna med hjälp av SNARE-handel. Det här är hudmelanocyter. De svartfärgade organellerna som du ser inuti cellerna kallas melanosomer.Melanosomer är kända som en klass av organeller som kallas lysozome relaterade organeller eller LRO. Återvinning endosomer är tubulära vesikulära organeller från tidiga eller sortering endosomer i alla celltyper. Dessa organeller spelar en nyckelroll i biogenesen av melanosomer, en lysozomrelaterad organell som produceras av melanocyter.Återvinning endosomer levererar den melanocytspecifika lasten till för tidiga melanosomer under bildandet. generering av återvinning endosomer som observerats i flera syndrom är celler i hyperpigmentering av hud, hår och öga. Därför är det användbart att studera dynamiken i återvinning endosomer för att förstå funktionen hos dessa organeller under normala och sjukdomstillstånd.Denna studie syftar till att mäta återvinning endosomes dynamik med hjälp av gripande SNARE syntaxin-13. Det första steget är sådd av musmelanocyter på förbehandlade täcken. Täck glasöverdragen i Petri-skålen i källarmembranmatrismedium.Och torka den i vävnadskulturhuven i 15 minuter. Tvätta täcksläparna en gång med 1X PBS före användning. Frö cellerna på källarmembranets mediumbelagda täckslipar vid 50 till 60% kompetens.Tillsätt alltid 200 nanomolar pma till den pläterade cellupphängningen i komplett RPMI-media. Efter sådd av cellerna, inkubera skålen som innehåller celler i CO2-inkubatorn i 12 till 24 timmar. Det andra steget är transfektion av celler med syntaxin-13 plasmider.Inkubera spetsarna som innehåller DNA och transfektreagens, blanda i fem minuter och blanda utan upprepad pipettering. Knacka på röret med handen var tionde minut i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna två gånger med 1X PBS, en gång med OPTI-MEM under inkubationen och tillsätt sedan 1 miljon OPTI-MEM till cellerna.Efter 30 minuters inkubation tillsätt transfektreagens-DNA-blandningen till cellerna på ett droppmässigt sätt genom att täcka skålen. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i sex timmar. Aspirera OPTI-MEM-mediet med transfekteringsreagens och tillsätt komplett RPMI-medium kompletterat med 200 nanomolarer PMA.Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 48 timmar. Det tredje steget är fixering av cellerna. Observera att följande procedur utförs utanför vävnadsodlingshuven.Efter 48 timmars transfektion, tvätta cellerna två gånger med 1X PBS och fixera sedan cellerna med 3% formaldehyd i 30 minuter. Efter fixering, tvätta cellerna två gånger med 1X PBS och förvara täckverktygen i 1X PBS tills vidare användning. Alternativt kan celler monteras på glasplattor eller lagras vid fyra grader Celsius.Det fjärde steget är immuntainering av cellerna. Förbered en fuktig kammare. Placera parafilmskuren bit på ett musfilterpapper i en Petri-skål.Täck med aluminiumfolie. Förbered 25 mikroliter av primär antikroppslösning. Tillsätt antikropp vid en utspädning på ett till 200.Tillsätt denna lösning som en droppe på parafilmen i den fuktiga kammaren. Lyft försiktigt täcksläckat med tång. Vänd den på droppen av primär antikroppsfärgningslösning och täck sedan locket på den fuktiga kammaren.Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. På samma sätt bereder du den sekundära antikroppslösningen vid en utspädning på en till 500 och placera den på parafilmen bredvid täckslipet i den fuktiga kammaren. För färgning av kärnan, tillsätt DAPI vid en utspädning av 120 000 till 130 000 till lösningen.Använd tång, plocka försiktigt upp täckdraget från den primära antikroppslösningen och doppa det två gånger i 1X PBS. Tryck på täcket på vävnadspapper för att ta bort överskottet av PBS på täcket. Placera den på den sekundära antikroppsfärgningslösningen i den fuktiga kammaren och utsätt den inte för ljuset på grund av närvaron av fluorescerande färgade antikroppar i lösningen.Efter inkubationen, plocka försiktigt upp täcket från den sekundära antikroppslösningen och doppa det sedan två gånger i 1X PBS. Tryck vidare på täcket på vävnadspapper för att ta bort överskottet av PBS på täcket. Placera 12 mikroliter av avbildningsreagens på en glasrutschbana och placera försiktigt det färgade täcket på monteringsreagenset.Vänd glasrutschbanan på vävnadspapperet och tryck sedan försiktigt. Föreställ sedan täcket med hjälp av ett fluorescensmikroskop och analysera bilderna med ImageJ. Det sjätte steget är kvantifieringen av överlappningen mellan återvinningsendosomlokaliserade proteiner och melanosomer.Kvantifiering av syntaxin-13 delta-129 colocalization med melanosomerna. Immunofluoreescence mikroskopi av syntaxin-13 i musen vilda typ melanocyter visade GFP-syntaxin-13 vilda-typ lokaliserade som vesicular och rörformiga strukturer. Och GFP-syntaxin-13 delta-129 lokaliserar ringliknande strukturer utöver cellytan.Vidare visade intracellulära ring-liknande GFP-syntaxin-13 delta-129 colocalization med melanosome protein TYRP1 i ljusa fält-avbildade melanosomer. Som visats tidigare observeras en kohort av överuttryckt GFP-syntaxin-13 vild typ i melanosomer. För att mäta den relativa lokaliseringen av GFP-syntaxin-13 vild typ och GFP-syntaxin-13 delta-129 till melanosomer, Fiji programvara användes och analys gjordes med JACOP plugin.Den uppmätta Manders överlappningskoefficient, det vill säga MOC, mellan GFP-syntaxin-13 delta-129 med TYRP1 är ungefär 1,5 gånger högre jämfört med GFP-syntaxin-13 vildtyp med TYRP1. Intressant nog visade TYRP1 2,9 veck högre MOC-värden med GFP-syntaxin-13 delta-129 jämfört med GFP-syntaxin-13 vild typ. Dessa data indikerar att lokaliseringen av GFP-syntaxin-13 delta-129 melanosomer är relativt högre jämfört med GFP-syntaxin-13 vild typ i ett stabilt tillstånd.Kvantifiering av syntaxin-13 lokalisering av typen av vilda typer av återvinningsendosomerna. Immunofluorescensmikroskopi av GFP-syntaxin-13 vilda typ visade colocalization med det kända återvinning endosomal protein rab11. MOC mellan GFP-syntaxin-13 vild typ med mCherry-Rab11 är ungefär 1,4 gånger högre jämfört med mCherry-Rab11 med GFP-syntaxin-13 vild typ.För att mäta antalet och längden på GFP-syntaxin-13 vilda typ positiva endosomala tubules, Fiji programvara användes enligt beskrivningen i protokollavsnittet. mCherry-Rab11 används en positiv kontroll i experimenten. Melanocyter transfected med GFP-syntaxin-13 vilda typ visade ett högre antal tubules per cell jämfört med celler som uttrycker mCherry-Rab11.Tubules reduceras dock vid uttryck av både GFP-syntaxin-13 vild typ och mCherry-Rab11 i cellerna. Det sjunde steget är kvantifieringen av återvinning endosomer'tubular antal och längd. Tubules reduceras vid uttryck av både GFP-syntaxin-13 vild typ och mCherry-Rab11 i cellerna.Intressant nog är den genomsnittliga tubulelängden från både GFP-syntaxin-13 vild typ och mCherry-Rab11 jämförbar med varandra i celler som uttrycker individuellt eller tillsammans. Tillsammans tyder dessa data på att GFP-syntaxin-13 vild typ lokaliserar till återvinning endosomer som liknar Rab11. Denna studie visade att N-terminal leverans av syntaxin-13 mutant, det vill säga GFP-syntaxin-13 delta-129, lokaliserar till melanosomer GFP-syntaxin-13 delta-129 kan eventuellt användas som reporter till vesikulär handel från återvinning endosomes till cellytan och LRO.Däremot lokaliserar GFP-syntaxin-13 vildtyp till återvinning av endosomer som liknar Rab11. Denna studie illustrerade att GFP-syntaxin-13 vild typ också kunde användas för märkning av återvinning endosomer i melanocyter. GFP-syntaxin-13 vild typ kan vara en bättre återvinning endosomal markör än Rab11, eftersom Rab11 ändrar endosomal dynamik.Sammantaget fungerar GFP-syntaxin-13 vild typ en potentiell återvinning endosomal markör för att studera dynamiken vid steady state förhållanden.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testa Visual Känsligheten för hastighet och rörelseriktning i Ödlor

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Datorgenererade djurmodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Använda optokinetic svar att studera visuell funktion zebrafisk

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Cell-baserade L-glutation Protection Analyser för att studera Endocytosis och återvinning av plasmamembranproteiner

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Riktade RNA Sequencing analys för att karaktärisera Gene Expression och Genomic Ändringar

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...