Name: the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklendi (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 to SRGS); Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (CRG/2019/000281 to SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 to SRGS) ve IISc-DBT ortaklık programı (SRGS'ye). Bölümdeki altyapı DST-FIST, DBT ve UGC tarafından desteklendi. AMB, DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02) tarafından desteklendi.

Protokol, melanositlerin tohumlenmesini ve ardından plazmidlerin transfeksiyonunu içerir. Diğer adımlar, RE'lerin uzunluğunu ve sayısını ölçmek için hücrelerin sabitlenmesi, immünostaining, görüntüleme ve analizini içerir. Protokolün ayrıntılı açıklaması aşağıda verilmiştir.
1. Önceden işlenmiş kapak örtülerinde fare melanositlerinin tohumlaştırılması
<ol><li>Cam kapakları bir Petri kabına (yani 35 mm'lik bir kapta 4 - 5) bodrum membran...

<ol>
	<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+building+BLOC(k)s+of+lysosomes+and+related+organelles.">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li><li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport.">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li><li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes.">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+adaptor+protein+(AP)-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes.">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li><li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes.">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li><li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles.">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis.">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li><li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2,+AP-3,+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles.">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li><li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes.">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li><li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles.">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li><li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery.">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li><li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis.">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes.">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).</li><li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers.">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).</li><li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermansky-Pudlak+syndrome:+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function.">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li><li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+lysosome-related+organelles:+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases.">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li><li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes.">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li><li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes.">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li><li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A.">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li><li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence.">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li><li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling.">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li><li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling.">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li><li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+at+the+recycling+endosome.">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li><li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+recycling+endosomes.">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li><li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes.">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li><li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system.">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li><li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+active:+protein+sorting+in+endocytic+recycling.">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li><li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling.">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li><li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin.">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li></ol>

Geri dönüşüm endozomları endosit organellerden oluşan bir kohort haline gelerek tüm hücre tiplerinde kargonun hücre yüzeyine geri dönüşümüne aracılık ederler21,22,23,24,25. Melanositler gibi özel hücre tiplerinde, bu organeller kısmen biyogenezleri için kaçakçılık rotalarını melanozomlara yönlendirmektedir3,16,26.<...

Melanin pigmentlerinin biyosentezi, geleneksel lizozomlarla birlikte var olan melanosit spesifik lizozomla ilişkili bir organel (LRO) olan melanozomlarda görülür. Endosit sistemi, iyonlaştırıcı radyasyona karşı cilt rengi ve fotoproteksiyon için gerekli olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar1,2,3. Bu işlem sırasında melanin sentezleme enzimleri erken/tasnif endozomları üzerinde sıralanır ve daha sonra geri dönüşüm endozomları (REs)4,5,6,7,8,9,10 adı verilen tübüler veya veziküler endozomlar aracılığıyla erken melanozomlara taşınır. Bu organellerin hedeflenmesi ve füzyonu, tamamen fonksiyonel pigmentli melanozomların olgunlaşmasını düzenler7,11,12,13,14. Bu organellerin oluşumundaki kusurlar veya bu organellere giden yük tasnifleri, Hermansky-Pudlak sendromunda gözlenen okülokütan albinizme ve diğer klinik fenotiplere neden olur15,16.
Burada REs'i incelemek ve analiz etmek için basit bir mikroskopi tabanlı tekniği açıklıyoruz. Bu yöntemde, geri dönüşüm endozomları17 ve melanositlerdeki endozomlar ve melanozomlar arasındaki döngüler üzerinde bulunan bir transmembran proteini olan Qa-SNARE Syntaxin (STX)13'den yararlandık12,18. Ayrıca, N-terminal yapılandırılmamış düzenleyici etki alanının (synn veya STX13Δ129) silinmesi, SNARE'nin melanozomlara doğru ileriye doğru kaçakçılık yolunu ölçen melanozomlarda sıkışmasını sağlar12. Çalışmalarımızda bilinen bir geri dönüşüm endosomal marker Rab GTPase (Rab)11 kullandık14,19. GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ve TYRP1 proteinlerinin vahşi tip melanositlerde floresan görüntülemesi ve ardından göreceli lokalizasyonlarının ölçülmesi, melanozomlara hedeflemelerinin yanı sıra RE'lerin doğasını ve dinamiklerini sağlayacaktır. Bu nedenle, bu, MELANOSITLERDEKI REs dinamiklerini görselleştirmek ve ölçmek için kullanılabilecek basit bir tekniktir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-TYRP1 antibody (TA99)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>022600-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol-12-myristate-13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the microscopy-based assay to study and analyze the recycling endosomes using snare trafficking

Geri dönüşüm endozomları (RE' ler), tüm hücre tiplerinde erken/sıralama endozomlarından üretilen tübüler-veziküler organellerdir. Bu organeller, melanositler tarafından üretilen lizozomla ilgili bir organel olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar. REs, melanosit spesifik kargoyu oluşumları sırasında prematüre melanozomlara teslim eder. Hermansky-Pudlak sendromunun birkaç mutantında gözlenen REs neslindeki tıkanıklık, cilt, saç ve göz hipopigmentasyonu ile sonuçlanır. Bu nedenle, REs'in dinamiklerini (sayı ve uzunluğa bakın) incelemek, bu organellerin normal ve hastalık koşullarındaki işlevini anlamak için yararlıdır. Bu çalışmada, yerleşik bir SNARE STX13 kullanarak RE dinamiklerini ölçmeyi amaçlıyoruz.

STX13Δ129 mutant lokalizasyonunun melanozomlara ölçülmesi Fare vahşi tip melanositlerinde STX13 immünofluoresans mikroskopisi, GFP-STX13WT'nin veziküler ve tübüler yapılar olarak lokalize olduğunu ve GFP-STX13Δ129'un hücre yüzeyine ek olarak halka benzeri yapılar olarak lokalize olduğunu göstermiştir (Şekil 1A). Ayrıca hücre içi halka benzeri GFP-STX13Δ129 melanozom protei...

Watch this Scientific Journal Video about The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking at JoVE.com

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Geri dönüşüm endozomları endosomal tübüler ağın bir parçasıdır. Burada, GFP-STX13'i organel işaretleyici olarak kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz.

SNARE Kaçakçılığı kullanarak Geri Dönüşüm Endozomlarını İncelemek ve Analiz Etmek için Mikroskopi Tabanlı Tahlil

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

SNARE kaçakçılığı kullanarak geri dönüşüm endozomlarını incelemek ve analiz etmek için mikroskopi bazlı tahlil. Bunlar deri melanositler. Hücrelerin içinde gördüğünüz siyah renkli organellere melanozom denir.Melanozomlar lizozom ile ilgili organeller veya LRO adı verilen bir organel sınıfı olarak bilinir. Geri dönüşüm endozomları erkenden tübüler veziküler organellerdir veya tüm hücre tiplerinde endozomları sıralarlar. Bu organeller, melanositler tarafından üretilen lizozomla ilgili bir organel olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar.Geri dönüşüm endozomları, oluşumları sırasında melanosit spesifik kargoyu prematüre melanozomlara ulaştırıyor. çeşitli sendromlarda gözlenen geri dönüşüm endozomlarının üretimi cilt, saç ve gözün hiperpigmentasyonundaki hücrelerdir. Bu nedenle, geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini incelemek, bu organellerin normal ve hastalık koşullarındaki işlevini anlamak için yararlıdır.Bu çalışma, SNARE sözdizimini-13'ün tutuklanmasını kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmeyi amaçlamaktadır. İlk adım, önceden işlenmiş kapak örtülerinde fare melanositlerinin tohumlaşılmasıdır. Cam kapakları Petri kabında bodrum membran matris ortamında kaplayın.Ve doku kültürü kaputunda 15 dakika kurutun. Kullanmadan önce kapakları 1X PBS ile bir kez yıkayın. Bodrum membran orta kaplamalı kapaklardaki hücreleri% 50 ila 60 yetkinlikte tohumla.Tam RPMI ortamlarında kaplamalı hücre süspansiyonu için her zaman 200 nanomolar PMA ekleyin. Hücreleri tohumladıktan sonra, CO2 inkübatörde hücre içeren kabı 12 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. İkinci adım, hücrelerin sözdizimi-13 plazmidlerle transfeksiyondur.DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren uçları kuluçkaya yatırın, beş dakika karıştırın ve tekrarlanan pipetleme olmadan karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her on dakikada bir elinizle tüpe dokunun. Kuluçka sırasında, hücreleri 1X PBS ile iki kez, opti-MEM ile bir kez yıkayın ve ardından hücrelere 1 mil OPTI-MEM ekleyin.30 dakikalık inkübasyon sonrası, transfeksiyon reaktif DNA karışımını yemeği kapatarak damla gibi hücrelere ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede altı saat kuluçkaya yatır. OPTI-MEM ortamını transfeksiyon reaktifi ile epire edin ve 200 nanomolar PMA ile desteklenmiş eksiksiz RPMI ortamı ekleyin.Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Üçüncü adım hücrelerin sabitlenmesidir. Aşağıdaki işlemin doku kültürü başlığı dışında yapıldığını lütfen unutmayın.48 saatlik transfeksiyondan sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve ardından hücreleri 30 dakika boyunca% 3 formaldehit ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve kapakları bir sonraki kullanıma kadar 1X PBS'de saklayın. Alternatif olarak, hücreler cam plakalara monte edilebilir veya dört santigrat derecede saklanabilir.Dördüncü adım hücrelerin immün yetimidir. Nemli bir oda hazırlayın. Parafilm kesim parçasını petri kabındaki fare filtresi kağıdına yerleştirin.Alüminyum folyo ile örtün. 25 mikrolitre birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bir ila 200 seyreltmede antikor ekleyin.Bu çözeltiyi nemli haznedeki parafilme bir damla olarak ekleyin. Kapak kapağını dikps ile dikkatlice kaldırın. Birincil antikor boyama çözeltisinin damlasında ters çevirin ve ardından nemli odanın kapağını kapatın.Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Benzer şekilde, ikincil antikor çözeltisini bir ila 500 seyreltmede hazırlayın ve nemli haznedeki kapak zarının yanındaki parafilme yerleştirin. Çekirdeği boyamak için, çözeltiye 120, 000 ila 130,000 seyreltmede DAPI ekleyin.Forseps kullanarak, kapak kapağını birincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve 1X PBS'de iki kez batırın. Kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Nemli haznedeki ikincil antikor boyama çözeltisine yerleştirin ve çözeltide floresan boyalı antikorların varlığı nedeniyle ışığa maruz bırakmayın.Kuluçkadan sonra, kapak kapağını ikincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve ardından 1X PBS'de iki kez batırın. Ayrıca, kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Cam bir kaydırağa 12 mikrolitre görüntüleme reaktifi yerleştirin ve lekeli kapak kapağını montaj reaktifine dikkatlice yerleştirin.Kağıt mendil üzerindeki cam kaydırağı ters çevirin ve ardından hafifçe bastırın. Ardından, kapak kapağını floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin ve ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin. Altıncı adım, geri dönüşüm endozom lokalize proteinleri ve melanozomlar arasındaki örtüşın nicelemesidir.Melanozomlarla sözdizimi-13 delta-129 kolokalizasyonunun ölçülmesi. Fare vahşi tip melanositlerinde sözdizimi-13 immünoforezans mikroskopisi, veziküler ve tübüler yapılar olarak lokalize GFP-sözdizimi-13 vahşi tip gösterdi. Ve GFP-sözdizimi-13 delta-129, hücre yüzeyine ek olarak halka benzeri yapıları lokalize eder.Ayrıca hücre içi halka benzeri GFP-sözdizimi-13 delta-129 parlak alan görüntülü melanozomlarda melanozom proteini TYRP1 ile kolokalizasyon gösterdi. Daha önce de gösterildiği gibi, melanozomlarda aşırı ifade edilmiş GFP-sözdizimi-13 vahşi tip bir kohort gözlenir. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin ve GFP-sözdizimi-13 delta-129'un melanozomlara göreli lokalizasyonunu ölçmek için Fiji yazılımı kullanıldı ve JACOP eklentisi ile analiz yapıldı.TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 delta-129 arasındaki ölçülen Mander'in örtüşme katsayısı, yani MOC, TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla yaklaşık 1,5 kat daha yüksektir. İlginçtir ki, TYRP1 GFP-sözdizimi-13 delta-129 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla 2,9 kat daha yüksek MOC değerleri gösterdi. Bu veriler, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarının lokalizasyonunun, sabit durumdaki GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla nispeten daha yüksek olduğunu göstermektedir.Geri dönüşüm endozomlarının sözdizimi-13 vahşi tip lokalizasyonunun nicelleştirilmesi. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinde immünoforezans mikroskopisi bilinen geri dönüşüm endosomal proteini Rab11 ile kolokalizasyon gösterdi. mCherry-Rab11 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi arasındaki MOC, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipine sahip mCherry-Rab11'e kıyasla yaklaşık 1,4 kat daha yüksektir.GFP-sözdizimi-13 vahşi tip pozitif endosomal tübüllerin sayısını ve uzunluğunu ölçmek için, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji yazılımı kullanılmıştır. mCherry-Rab11 deneylerde pozitif bir kontrol kullanılır. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi ile trans enfekte olan melanositler, mCherry-Rab11'i ifade eden hücrelere kıyasla hücre başına daha yüksek sayıda tübül gösterdi.Bununla birlikte, tübüller hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de hücrelerde mCherry-Rab11'in birlikte ifadelanmasıyla azalır. Yedinci adım, geri dönüşüm endozomlarının borulu sayısı ve uzunluğunun ölçülmesidir. Tübüller, hücrelerde hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de mCherry-Rab11'in birlikte ifadelenmesiyle azalır.İlginçtir ki, hem GFP-sözdizimi-13 vahşi türünden hem de mCherry-Rab11'den ortalama tübül uzunluğu, ayrı ayrı veya birlikte ifade eden hücrelerde birbiriyle karşılaştırılabilir. Birlikte, bu veriler GFP-sözdizimi-13 vahşi türünün Rab11'e benzer şekilde geri dönüşüm endozomlarına yerelleşerek yerelleştirdiğini göstermektedir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 delta-129 olan sözdizimi-13 mutantının N-terminal teslimatının, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarına lokalize olduğunu, muhtemelen geri dönüşüm endozomlarından hücre yüzeyine ve LRO'ya ve LRO'ya veziküler kaçakçılığın muhabiri olarak kullanılabileceğini göstermiştir.Buna karşılık, GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, endozomların Rab11'e benzer şekilde geri dönüştürülmesini yerelleştirir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin melanositlerde geri dönüşüm endozomlarını işaretlemek için de kullanılabileceğini göstermektedir. GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, Rab11 endosomal dinamikleri değiştirdiğinden, Rab11'den daha iyi bir geri dönüşüm endosomal işaretleyici olabilir.GFP-syntaxin-13 vahşi tipi, dinamikleri sabit durum koşullarında incelemek için potansiyel bir geri dönüşüm endosomal işaretleyicisi görevi görür.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...