Celgebaseerde therapie heeft een enorm potentieel voor hersenregeneratie. Het protocol dat we hier demonstreren is waardevol, omdat het longitudinale in vivo beeldvorming van getransplanteerde cellen in het muizenbrein mogelijk maakt. Dit protocol is vooral handig om inzicht te krijgen in de migratie en de overleving van het transplantaat in hetzelfde dier over een bepaalde periode.
Deze procedure kan worden toegepast op elke luciferase-expresserende cellijn die naar de hersenen van de muis wordt getransplanteerd. De signaalsterkte kan echter variëren afhankelijk van de diepte van de transplantatie of de luciferase-expressie in de respectieve cellijn. Rebecca Weber, een uitstekende promovendus in ons laboratorium, demonstreert de procedure.
Begin met het verzamelen van een flacon met cellen van minus 150 graden Celsius opslag en breng het over naar het laboratorium. Breng de injectieflacon snel over in een waterbad dat gedurende twee tot drie minuten is getemperd op 37 graden Celsius totdat ijskristallen oplossen. Breng vervolgens de injectieflacon over naar de bioveiligheidskast en pipetteer de hele inhoud in een steriele conische buis van 15 milliliter.
Voeg negen milliliter steriel PBS toe en centrifugeer bij 300 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant door aspiratie zonder de pellet te verstoren en tel de cellen voor de laatste spin met behulp van een geautomatiseerde celteller. Transporteer het dier van de inductiekamer naar het stereotaxische frame en behoud de anesthesie met behulp van een gezichtsmasker.
Breng oogheelkundig glijmiddel aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen. Scheer de hoofdhuid van de muis met een elektrisch scheermes en desinfecteer de huid met 5% betadine-oplossing met wattenstaafjes. Zet de muiskop vast en steek de oorstaven in de externe meatus.
Boor een gat met een diameter van twee tot drie millimeter door de schedel met een chirurgische tandartsboor. Resuspend de voorbereide cellen in de buis en trek twee microliter celsuspensie in een spuit. Plaats de spuit boven de doelplaats en beweeg de naald langzaam naar het oppervlak van de dura en bereken de dieptecoördinaten.
Dubbelklik op het pictogram Living Image-software en selecteer een gebruikers-ID in de vervolgkeuzelijst. Klik vervolgens op Initialiseren in het Configuratiescherm dat wordt weergegeven. Schakel in de Living Image-software de selectievakjes Luminescent en Photograph in het Configuratiescherm in en selecteer Automatische belichting.
Selecteer een gezichtsveld. Voer de hoogte van het onderwerp in en selecteer de optie Voor het scherpstellen van de hoogte van het onderwerp gebruiken. Stel handmatig de filterparameters in, waaronder grote Binning, F/Stop, geblokkeerd excitatiefilter en open emissiefilter.
Injecteer de luciferine intraperitoneaal en verdoof dieren na vijf minuten met een continue isofluraantoevoer. Scheer de verdoofde dieren op het hoofdgebied met behulp van een conventioneel scheerapparaat. Plaats het dier in de beeldvormingskamer en begin 15 minuten na de luciferine-injectie met beeldvorming door in het configuratiescherm op Verwerven te klikken.
Voordat neurale voorlopercellen in het muizenbrein werden getransplanteerd, werden de cellen getest op succesvolle transductie door expressie van EGFP in vitro. De succesvolle transplantatie werd bevestigd door de aanwezigheid van het rode Firefly luciferase signaal. Na transplantatie van 6.000 tot 180.000 cellen in de rechter sensorische motorische cortex van de muis was het bioluminescentiesignaal bij alle concentraties detecteerbaar.
De cellen overleefden minstens vijf weken na transplantatie. De getransplanteerde cellen werden met succes ex vivo gedetecteerd in een daaropvolgende histologische analyse via de EGFP-reporter en immunostaining met anti-menselijke kernen. Het is erg belangrijk om de injectiecoördinaten zorgvuldig te berekenen om te voorkomen dat u de doellocatie mist.
En laat de spuit ook minstens vijf minuten na de transplantatie op zijn plaats om reflux te voorkomen. Na in vivo bioluminescente beeldvorming kan het hersenweefsel worden voorbereid voor histologische analyse, of de getransplanteerde cellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van FACS en worden gekenmerkt met verschillende of gemengde technologieën. Over het algemeen biedt deze techniek een kwantitatieve en continue tracking van getransplanteerde cellen in de hersenen, en het kan worden toegepast op een groot aantal neurologische ziekten, waaronder beroerte en traumatisch hersenletsel.
