Клеточная терапия имеет огромный потенциал для регенерации мозга. Протокол, который мы демонстрируем здесь, ценен, поскольку он позволяет проводить продольную визуализацию in vivo трансплантированных клеток в мозге мыши. Этот протокол особенно полезен для получения информации о миграции и выживании трансплантата у одного и того же животного в течение определенного периода времени.
Эта процедура может быть применена к любой люциферазной экспрессирующей клеточной линии, пересаженной в мозг мыши. Однако сила сигнала может варьироваться в зависимости от глубины трансплантации или экспрессии люциферазы в соответствующей клеточной линии. Продемонстрировать процедуру будет Ребекка Вебер, отличница phD в нашей лаборатории.
Начните со сбора флакона с клетками при температуре минус 150 градусов Цельсия и перенесите его в лабораторию. Быстро переложите флакон на водяную баню, закаленную при температуре 37 градусов Цельсия, в течение двух-трех минут, пока кристаллы льда не растворятся. Затем переложите флакон в шкаф биобезопасности и пипетку всего содержимого в стерильную 15-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте девять миллилитров стерильного PBS и центрифугу при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант путем аспирации, не нарушая гранулу, и подсчитайте ячейки перед окончательным вращением с помощью автоматизированного счетчика клеток. Транспортируйте животное из индукционной камеры в стереотаксическую рамку, поддерживая анестезию с помощью маски для лица.
Нанесите офтальмологическую смазку, чтобы предотвратить высыхание глаз. Сбрить кожу головы мыши электрической бритвой и продезинфицировать кожу 5% раствором бетадина с помощью ватных тампонов. Закрепите головку мыши и вставьте ушные вкладыши во внешний меатус.
Просверлите отверстие диаметром два-три миллиметра через череп хирургическим бормашилом. Повторно суспендируйте подготовленные ячейки в трубке и втяните два микролитра клеточной суспензии в шприц. Поместите шприц над целевым участком и медленно переместите иглу к поверхности твердой мозговой оболочки и рассчитайте координаты глубины.
Дважды щелкните значок программного обеспечения Living Image и выберите идентификатор пользователя из раскрывающегося списка. Затем нажмите кнопку Инициализировать на появившейся панели управления. В программном обеспечении Living Image установите флажки Люминесцент и Фотография на панели управления и выберите Автоматическая экспозиция.
Выберите поле зрения. Введите высоту объекта и выберите параметр фокусировки «Использовать высоту объекта». Вручную задайте параметры фильтрации, включая большой Binning, F/Stop, заблокированный фильтр возбуждения и открытый фильтр излучения.
Вводят люциферин внутрибрюшинно, а через пять минут обезболивают животных непрерывным поступлением изофлурана. Побрите успокоенных животных на области головы с помощью обычной бритвы для волос. Поместите животное в камеру визуализации и начните визуализацию через 15 минут после инъекции люциферина, нажав кнопку «Получить» на панели управления.
Перед трансплантацией нейронных клеток-предшественников в мозге мыши клетки были протестированы на успешную трансдукцию экспрессией EGFP in vitro. Успешная трансплантация была подтверждена наличием красного сигнала люциферазы светлячка. После трансплантации от 6 000 до 180 000 клеток в правой сенсорно-моторной коре мыши сигнал биолюминесценции был обнаружен при всех концентрациях.
Клетки выживали в течение как минимум пяти недель после трансплантации. Трансплантированные клетки были успешно обнаружены ex vivo в последующем гистологическом анализе с помощью репортера EGFP и иммуноокрашивания античеловеческими ядрами. Очень важно тщательно рассчитать координаты инъекции, чтобы не пропустить целевое место.
А также оставьте шприц на месте в течение как минимум пяти минут после трансплантации, чтобы избежать рефлюкса. После биолюминесцентной визуализации in vivo ткань мозга может быть либо подготовлена к гистологическому анализу, либо пересаженные клетки могут быть выделены с использованием FACS и охарактеризованы различными или смешанными технологиями. В целом, эта методика обеспечивает количественное и непрерывное отслеживание пересаженных клеток в головном мозге, и ее можно применять к огромному количеству неврологических заболеваний, включая инсульт и черепно-мозговую травму.
