यहां, हम एक वर्कफ़्लो प्रदान करते हैं जिसमें माइक्रोबायोम पर ग्लाइफोसेट के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोगों का संचालन करने के लिए सबसे अच्छी जैव सूचना विज्ञान विधि शामिल है। मुख्य लाभ यह है कि यह भविष्य के क्षेत्र और प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए एक मजबूत परीक्षण योग्य परिकल्पना प्रदान करता है। वर्णित पद्धति को पौधों, जानवरों और रोगाणुओं सहित विभिन्न प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।
कार्यप्रणाली का प्रत्येक भाग काफी सीधा है। शायद सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा एक बहुआयामी टीम को एकीकृत करना है जो काम के विभिन्न हिस्सों को करने में सक्षम है। प्रक्रिया का प्रदर्शन सूनी मैथ्यू, मेरी प्रयोगशाला से एक शोधकर्ता होगा.
शुरू करने के लिए, प्रयोगात्मक क्षेत्र को नियंत्रण के 10 प्रतिकृतियों में विभाजित करके प्रयोग शुरू करें और भूखंडों के बीच वनस्पति के बफर स्ट्रिप्स के साथ GBP उपचार। कृषि प्रथाओं में अधिकतम अनुमत ग्लाइफोसेट खुराक की नकल करने के लिए नल के पानी और वाणिज्यिक GBP के साथ GBP भूखंडों के साथ नियंत्रण भूखंडों का इलाज करें। प्रयोगात्मक पौधों से माइक्रोबायोटा का नमूना लें।
क्षेत्र से पौधे के नमूनों की 10 प्रतिकृतियों को इकट्ठा करें, तुरंत उन्हें बर्फ पर रखें और उन्हें आगे के प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में लाएं। प्रयोग दो के लिए, लकड़ी के शेविंग, मल, और 12 महीने के एवियरी प्रयोग में जीबीपी दूषित या नियंत्रण फ़ीड पर खिलाए गए बटेर से कुछ बिखरे हुए फ़ीड सहित बिस्तर एकत्र करें। इसे फैलने के बाद सीधे ग्लाइफोसेट एकाग्रता माप के लिए एक मान्यता प्राप्त प्रयोगशाला में बिस्तर के नमूने भेजें।
अपनी जड़ और पत्ती माइक्रोबायोटा का अध्ययन करने के लिए प्रत्येक भूखंड में बारहमासी घास और स्ट्रॉबेरी के पौधे लगाएं। पौधे के नमूनों को धोने और निष्फल करके एंडोफाइटिक रोगाणुओं की पहचान करें और उन्हें हटा दें। एक बार जब नमूनों को निष्फल कर दिया जाता है, तो निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालें।
एक नेस्टेड दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, 16S rRNA जीन के चर क्षेत्रों V6 से V8 तक बढ़ाएं और पाठ पांडुलिपि में वर्णित नमूनों की आवश्यक संख्या के लिए PCR मास्टर मिश्रण करें। पीसीआर के पहले दौर के लिए, प्राइमर 799 फॉरवर्ड और 1492 रिवर्स का उपयोग करें। 35 चक्रों के लिए thermocycler में प्रवर्धन प्रोफ़ाइल सेट करें।
प्रवर्धन को सत्यापित करने के लिए, प्रवर्धित उत्पाद के पांच माइक्रोलीटर का उपयोग करके वैद्युतकणसंचलन करें और फिर पीसीआर उत्पाद के शेष 25 माइक्रोलीटर को एक से 10 के अनुपात में ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी में पतला करें। सार्वभौमिक प्राइमरों 1062 आगे और 1390 रिवर्स का उपयोग करते हुए, 25 चक्रों के साथ प्रवर्धन के दूसरे दौर का संचालन करें। एक समान अनुपात पर autoclaved ultrapure पानी में परिणामी पीसीआर उत्पादों को पतला.
बारकोड और पी 1 एडाप्टर अनुक्रम के साथ उत्पादों को टैग करने के लिए आठ चक्रों के साथ प्रवर्धन के तीसरे दौर को पूरा करें। एक bioanalyzer पर पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता में एकाग्रता को सत्यापित करें और एक equimolar पुस्तकालय तैयार करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक नमूने के डीएनए के 30 नैनोग्राम का गठन मात्रा पूल। एक agarose जेल कैसेट पर एक स्वचालित डीएनए आकार चयन प्रणाली का उपयोग कर आकार fractionation द्वारा आकार 350 से 550 आधार जोड़े के amplicons का चयन करें।
कैसेट में एक शीशी में निर्दिष्ट आकार के amplicons युक्त elute ले लीजिए जिसके परिणामस्वरूप एक शुद्ध 16S rRNA जीन पुस्तकालय में. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्रित eluent स्थानांतरण और शुद्धता और bioanalyzer पर एकाग्रता सत्यापित करें। 26 picomolar की एक अंतिम एकाग्रता के लिए autoclaved ultrapure पानी का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालय पतला.
आईटीएस क्षेत्र को बढ़ाने के लिए, आईटीएस प्राइमरों के साथ प्रतिक्रिया स्थापित करने के बाद, थर्मोसाइकिलर पर प्रवर्धन प्रोफ़ाइल सेट करें। फिर 1.5% agarose जेल पर प्रवर्धित उत्पाद के पांच माइक्रोलीटर का विश्लेषण करें और ऑटोक्लेव्ड अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके एक से 10 के अनुपात में उत्पाद के शेष 25 माइक्रोलीटर को पतला करें। बारकोड-टैग किए गए फॉरवर्ड प्राइमर और पी 1 एडाप्टर-टैग किए गए रिवर्स प्राइमर के साथ नमूनों की आवश्यक संख्या के लिए पीसीआर मास्टर मिश्रण बनाएं।
टेम्पलेट के रूप में पतला पीसीआर उत्पाद का उपयोग करते हुए, प्रवर्धन के दूसरे दौर का संचालन करें। 16S rRNA जीन के लिए पुस्तकालय की तैयारी के समान, शुद्ध ITS क्षेत्र के लिए पुस्तकालय तैयार करें। EPSPS प्रोटीन अनुक्रम के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण शुरू करें।
सर्वर प्रदान किए गए आउटपुट से ग्लाइफोसेट करने के लिए क्वेरी अनुक्रम की संभावित संवेदनशीलता का आकलन करें जहां आउटपुट एक क्वेरी अनुक्रमों में मौजूद अमीनो एसिड मार्करों के अंश और रूपांकनों की संख्या को दर्शाता है। आउटपुट दो मार्कर अवशेषों के आधार पर क्वेरी और संदर्भ अनुक्रमों के संरेखण को दर्शाता है। आउटपुट तीन क्वेरी और संदर्भ अनुक्रमों के पूर्ण जोड़ी-वार संरेखण दिखाता है।
आउटपुट चार Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis, और Streptomyces davawensis के EPSPS संदर्भ अनुक्रमों से पता चलता है। आउटपुट पृष्ठ के अंत में, क्वेरी EPSPS अनुक्रम का और विश्लेषण करने के लिए BLASTp और संरक्षित डोमेन जैसे बाहरी उपकरणों के लिंक ढूँढें. सार्वजनिक रिपॉजिटरी से EPSPS अनुक्रमों की पहचान करने के बाद, इन डेटासेट को EPSPS क्लास सर्वर के मुख्य पृष्ठ से एक्सेस करें जिसमें टैक्सोनोमिक जानकारी और 50, 000 से अधिक अनुक्रमों के EPSPS वर्ग शामिल हैं।
GBP में पौधों के विकास की तुलना करने और भूखंडों को नियंत्रित करने के लिए क्षेत्र के मौसम के अंत में पौधों के ऊपर-जमीन बायोमास का वजन करें। एक स्प्रेडशीट में, माइक्रोबायोम प्रयोगों के लिए बैक्टीरियल ओटीयू को पूर्व-परिकलित डेटासेट में मैप करें। और एक संभाव्य स्कोर के आधार पर, ग्लाइफोसेट के लिए आंतरिक संवेदनशीलता की गणना करें।
इस विधि का उपयोग सूक्ष्म विकासवादी स्तर पर ईपीएसपीएस प्रोटीन में संवेदनशीलता में परिवर्तन को मापने के लिए किया गया था। हमने विश्लेषण किए गए प्रोकैरियोट्स के 32 में से 12 निकटसे संबंधित समूहों में संवेदनशीलता की स्थिति में परिवर्तन की पहचान की। इस प्रकार, ग्लाइफोसेट-आधारित उत्पादों का निरंतर उपयोग पौधे, जानवरों और मिट्टी के माइक्रोबायोम में माइक्रोबियल डिस्बिओसिस का उत्पादन कर सकता है।
इष्टतम amplicon पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए पूर्व और बाद पीसीआर प्रक्रियाओं की गुणवत्ता सुनिश्चित करें। यह भी सुनिश्चित करें कि EPSPS प्रोटीन अनुक्रम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने से पहले आंशिक नहीं है। क्षेत्र प्रयोगों में, ग्लाइफोसेट के साथ नियंत्रण के संदूषण को रोकने के लिए सुनिश्चित करें।