여기에서, 우리는 글리포세이트가 마이크로바이옴에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험을 수행하기 위한 최상의 생물정보학 방법을 포함하는 워크플로우를 제공한다. 가장 큰 장점은 미래의 현장 및 실험실 실험을위한 강력한 테스트 가능한 가설을 제공한다는 것입니다. 설명된 방법론은 식물, 동물 및 미생물을 포함하는 다양한 시스템에 적용될 수 있다.
방법론의 각 부분은 매우 간단합니다. 아마도 가장 어려운 부분은 작업의 다른 부분을 수행 할 수있는 여러 분야의 팀을 통합하는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Suni Matthew가 될 것입니다.
시작하려면 실험 필드를 플롯 사이에 식물의 버퍼 스트립으로 대조군과 GBP 처리의 10 번의 반복실험으로 나눠서 실험을 시작하십시오. 대조군 플롯을 수돗물로 처리하고 GBP 플롯을 상업용 GBP로 처리하여 농업 관행에서 허용되는 최대 글리포세이트 복용량을 모방하십시오. 실험 식물에서 미생물을 샘플링하십시오.
현장에서 식물 샘플의 10 반복본을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓고 추가 처리를 위해 실험실로 가져 오십시오. 두 번째 실험의 경우, 12 개월 조류 실험에서 GBP로 오염 된 메추라기에서 나무 부스러기, 대변 및 일부 엎질러 진 사료를 포함한 침구를 수집하십시오. 침구 샘플을 확산 후 직접 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내십시오.
다년생 풀과 딸기 식물을 각 플롯에 심어 뿌리와 잎 미생물을 연구하십시오. 식물 샘플을 세척 및 멸균하여 내피 미생물을 확인하고 제거하십시오. 샘플이 멸균되면 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.
중첩된 접근법을 사용하여, 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V6 내지 V8을 증폭시키고, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 필요한 수의 샘플에 대해 PCR 마스터 믹스를 만든다. PCR의 첫 번째 라운드에서는 프라이머 799 포워드와 1492 역전을 사용하십시오. 35 사이클 동안 열순환기에서 증폭 프로파일을 설정하십시오.
증폭을 확인하기 위해 5 마이크로 리터의 증폭 된 생성물을 사용하여 전기 영동을 수행 한 다음 나머지 25 마이크로 리터의 PCR 산물을 오토클레이브 초순수에 1 ~ 10의 비율로 희석하십시오. 범용 프라이머(1062)를 정방향 및 역방향(1390)을 사용하여, 25 사이클의 증폭의 두 번째 라운드를 수행한다. 생성된 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 동일한 비율로 희석한다.
여덟 번의 주기로 세 번째 증폭 라운드를 수행하여 제품에 바코드 및 P1 어댑터 시퀀스를 태그합니다. 바이오분석기 상에서 PCR 산물의 품질 농도를 검증하고, 각 샘플의 DNA의 30나노그램을 구성하는 부피를 1.5밀리리터 튜브에 풀링하여 등몰 라이브러리를 제조하였다. 아가로스 겔 카세트에서 자동화된 DNA 크기 선택 시스템을 사용하여 크기 분별에 의해 크기 350 내지 550 염기쌍의 앰플리콘을 선택하십시오.
지정된 크기의 앰플리콘을 포함하는 용출액을 카세트에 바이알에 넣고 수집하여 정제된 16S rRNA 유전자 라이브러리를 생성한다. 수집 된 용리액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 바이오 분석기의 순도 및 농도를 확인합니다. 오토클레이브된 초순수를 사용하여 DNA 라이브러리를 최종 농도 26 피코몰로 희석한다.
ITS 영역을 증폭시키기 위해, ITS 프라이머로 반응을 설정한 후, 열순환기 상에 증폭 프로파일을 설정한다. 그런 다음 증폭 된 생성물의 5 마이크로 리터를 1.5 % 아가로스 겔에서 분석하고 오토클레이브 된 초순수를 사용하여 나머지 25 마이크로 리터의 생성물을 1 ~ 10의 비율로 희석하십시오. 바코드 태그가 지정된 정방향 프라이머 및 P1 어댑터 태그가 지정된 역방향 프라이머를 사용하여 필요한 수의 샘플에 대해 PCR 마스터 믹스를 만듭니다.
희석된 PCR 산물을 주형으로 사용하여, 증폭의 두 번째 라운드를 실시한다. 16S rRNA 유전자에 대한 라이브러리 제제와 유사하게, 정제된 ITS 영역에 대한 라이브러리를 준비한다. EPSPS 단백질 서열의 생물정보학 분석을 개시한다.
서버 제공 출력으로부터 글리포세이트에 대한 질의 서열의 잠재적 민감도를 평가하고, 여기서 출력은 질의 서열에 존재하는 아미노산 마커의 분획 및 모티프의 수를 나타낸다. 출력 두 개는 마커 잔기에 기초한 질의 및 참조 서열의 정렬을 나타낸다. 출력 세 개는 쿼리 및 참조 시퀀스의 전체 쌍 단위 정렬을 보여 줍니다.
출력 네 개는 Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis 및 Streptomyces davawensis의 EPSPS 참조 서열을 보여줍니다. 출력 페이지의 끝에서 BLASTp 및 보존된 도메인과 같은 외부 도구에 대한 링크를 찾아 쿼리 EPSPS 시퀀스를 추가로 분석합니다. 공용 저장소에서 EPSPS 시퀀스를 식별한 후 분류 정보가 포함된 EPSPS 클래스 서버의 기본 페이지와 50,000개 이상의 시퀀스의 EPSPS 클래스에서 이러한 데이터 세트에 액세스합니다.
필드 시즌이 끝날 때 식물의 지상 바이오 매스를 계량하여 GBP와 대조군 플롯에서 식물의 성장을 비교하십시오. 스프레드시트에서 마이크로바이옴 실험을 위한 박테리아 OTU를 미리 계산된 데이터 세트에 매핑합니다. 그리고 확률적 점수에 기초하여, 글리포세이트에 대한 내재적 민감도를 계산한다.
이 방법은 EPSPS 단백질의 민감도 변화를 미세진화 수준에서 정량화하는데 사용되었다. 우리는 분석 된 원핵 생물의 밀접하게 관련된 32 그룹 중 12 개에서 민감도 상태의 변화를 확인했습니다. 따라서, 글리포세이트계 제품의 지속적인 사용은 식물, 동물 및 토양 미생물에서 미생물 이형성을 생성할 수 있다.
최적의 앰플리콘 라이브러리를 얻기 위해 PCR 전후 절차의 품질을 보장하십시오. 또한 소프트웨어를 사용하기 전에 EPSPS 단백질 서열이 부분적이지 않은지 확인하십시오. 현장 실험에서 글리포세이트로 컨트롤의 오염을 방지해야 합니다.
