Her tilbyr vi en arbeidsflyt som inkluderer den beste bioinformatikkmetoden for å utføre forsøkene for å vurdere effekten av glyfosat på mikrobiomer. Den største fordelen er at den gir en robust testbar hypotese for fremtidige felt- og laboratorieforsøk. Den beskrevne metodikken kan brukes på en rekke systemer, inkludert planter, dyr og mikrober.
Hver del av metodikken er ganske grei. Kanskje det mest utfordrende er å integrere et tverrfaglig team som er i stand til å utføre forskjellige deler av arbeidet. Å demonstrere prosedyren vil være Suni Matthew, en forsker fra laboratoriet mitt.
Til å begynne med, begynn å eksperimentere en ved å dele det eksperimentelle feltet i 10 replikeringer av kontroll og GBP-behandling med bufferstrimler av vegetasjon mellom tomtene. Behandle kontrollplottene med vann fra springen og GBP-tomtene med kommersiell GBP for å etterligne maksimal tillatt glyfosatdosering i landbrukspraksis. Prøv mikrobiota fra eksperimentelle planter.
Samle 10 replikeringer av planteprøvene fra feltet, legg dem umiddelbart på is og ta dem med til laboratoriet for videre behandling. For eksperiment to, samle sengetøy, inkludert trespon, avføring og noe sølt fôr fra vaktler matet på GBP forurenset eller kontroll feeds i et 12-måneders aviary eksperiment. Send sengetøyprøvene til et akkreditert laboratorium for glyfosatkonsentrasjonsmålingene rett etter at den er spredt.
Plante flerårig gress og jordbærplanter i hvert tomt for å studere deres rot og bladmikrobiota. Identifiser og fjern de endofytiske mikrober ved å vaske og sterilisere planteprøvene. Når prøvene er sterilisert, trekker du ut genomisk DNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig dna-ekstraksjonssett for planter etter produsentens protokoll.
Ved hjelp av en nestet tilnærming, forsterk de variable områdene V6 til V8 av 16S rRNA-genet og gjør PCR master mix for det nødvendige antall prøver som beskrevet i tekstmanuskriptet. For første runde av PCR, bruk primere 799 fremover og 1492 omvendt. Sett opp forsterkningsprofilen i termosykleren i 35 sykluser.
For å verifisere forsterkning, utfør elektroforese ved hjelp av fem mikroliter forsterket produkt og fortynn deretter resten 25 mikroliter av PCR-produktet i autoklavert ultrarent vann i forholdet fra en til 10. Bruk de universelle primerne 1062 forover og 1390 revers, utfør den andre runden med forsterkning med 25 sykluser. Fortynn de resulterende PCR-produktene i autoklavert ultrarent vann med et likt forhold.
Utfør den tredje runden med forsterkning med åtte sykluser for å merke produktene med strekkodene og P1-adaptersekvensen. Kontroller konsentrasjonen i kvaliteten på PCR-produkter på en bioanalyse og slå sammen volumene som utgjør 30 nanogram DNA av hver prøve i et 1,5 milliliterrør for å forberede et equimolarbibliotek. Velg amlikonene i størrelse 350 til 550 basepar etter størrelsesfraksjonering ved hjelp av et automatisert DNA-størrelsesvalgsystem på en agarose gelkassett.
Samle elute som inneholder amplikonene av den angitte størrelsen i et hetteglass i kassetten, noe som resulterer i et renset 16S rRNA genbibliotek. Overfør den innsamlede eluenten til et 1,5 milliliterrør og kontroller renheten og konsentrasjonen på bioanalysen. Fortynn DNA-biblioteket ved hjelp av autoklavert ultrarent vann til en endelig konsentrasjon på 26 picomolar.
For å forsterke ITS-regionen, etter å ha satt opp reaksjonen med ITS primere, sett forsterkningsprofilen på termosykleren. Analyser deretter fem mikroliter av det forsterkede produktet på 1,5% agarose gel og fortynn de resterende 25 mikroliter av produktet i forholdet 1 til 10 ved hjelp av autoklavert ultrapure vann. Lag PCR-hovedmiks for det nødvendige antallet prøver med strekkodemerkede fremoverprimere og P1-adaptermerkede omvendte primere.
Bruk det fortynnede PCR-produktet som mal, utfør den andre runden med forsterkning. I likhet med bibliotekforberedelsene for 16S rRNA-genet, klargjør biblioteket for den rensede ITS-regionen. Initiere bioinformatikkanalysene av EPSPS-proteinsekvensen.
Vurder den potensielle følsomheten til spørringssekvensen for glyfosat fra de angitte utgangene der utdata én viser brøkdelen av aminosyremarkører som finnes i spørringssekvensene og antall motiver. Utdata to viser justeringer av spørringen og referansesekvensene basert på markørrester. Utdata tre viser fullstendige parvise justeringer av spørrings- og referansesekvensene.
Utgang fire viser EPSPS referansesekvenser av Vibrio kolerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis og Streptomyces davawensis. På slutten av utdatasiden finner du koblinger til eksterne verktøy som BLASTp og konserverte domener for å analysere EPSPS-sekvensen for spørringen ytterligere. Når du har identifisert EPSPS-sekvensene fra de offentlige repositoriene, får du tilgang til disse datasettene fra EPSPS-klasseserverens hovedside som inneholder taksonomisk informasjon og EPSPS-klassen på over 50 000 sekvenser.
Vei over bakken biomasse av plantene på slutten av feltsesongen for å sammenligne veksten av plantene i GBP og kontrollplott. I et regneark tilordner du bakterielle OTUer for mikrobiomeeksperimenter til forhåndsberegnet datasett. Og basert på en probabilistisk poengsum, beregn den indre følsomheten for glyfosat.
Denne metoden ble brukt til å kvantifisere endringer i følsomhet i EPSPS-proteinet på mikro evolusjonært nivå. Vi identifiserte endringer i sensitivitetsstatus i 12 av 32 nært beslektede grupper av prokaryoter analysert. Dermed kan glyfosatbaserte produkters kontinuerlige bruk produsere mikrobiell dysbiose i plante-, dyre- og jordmikrobiomer.
Sikre kvaliteten på pre- og post-PCR-prosedyrer for å oppnå optimale amplikonbiblioteker. Kontroller også at EPSPS-proteinsekvensen ikke er delvis før du bruker programvaren. Ved felteksperimenter må du sørge for å forhindre forurensning av kontroller med glyfosat.
