Här tillhandahåller vi ett arbetsflöde som innehåller den bästa bioinformatikmetoden för att genomföra experimenten för att bedöma effekten av glyfosat på mikrobiom. Den största fördelen är att den ger en robust testbar hypotes för framtida fält- och laboratorieexperiment. Den beskrivna metoden kan tillämpas på en mängd olika system, inklusive växter, djur och mikrober.
Varje del av metoden är ganska enkel. Den kanske mest utmanande delen är att integrera ett tvärvetenskapligt team som kan utföra olika delar av arbetet. Demonstrerar proceduren kommer att vara Suni Matthew, en forskare från mitt laboratorium.
Börja med att experimentera ett genom att dela upp experimentfältet i 10 replikat av kontroll och GBP-behandling med buffertremsor av vegetation mellan tomterna. Behandla kontrolltomterna med kranvatten och GBP-tomterna med kommersiell GBP för att efterlikna den maximala tillåtna glyfosatdoseringen i jordbruksmetoder. Prova mikrobioten från experimentella växter.
Samla 10 replikat av växtproverna från fältet, placera dem omedelbart på is och ta dem till laboratoriet för vidare bearbetning. För experiment två, samla sängkläder, inklusive träspån, avföring och lite spillt foder från vaktlar som matas på GBP-förorenade eller kontrollfoder i ett 12-månaders aviary experiment. Skicka ströproverna till ett ackrediterat laboratorium för mätningar av glyfosatkoncentrationen direkt efter att det har spridits.
Plantera fleråriga gräs- och jordgubbsväxter i varje tomt för att studera deras rot- och bladmikrobiota. Identifiera och ta bort de endofytiska mikroberna genom att tvätta och sterilisera växtproverna. När proverna är steriliserade, extrahera genomiskt DNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt växt-DNA-extraktionssats enligt tillverkarens protokoll.
Med hjälp av en kapslad metod förstärker du de variabla regionerna V6 till V8 i 16S rRNA-genen och gör PCR-masterblandning för det önskade antalet prover som beskrivs i textmanuskriptet. För den första omgången av PCR, använd primers 799 framåt och 1492 bakåt. Ställ in förstärkningsprofilen i termocyklisten i 35 cykler.
För att verifiera förstärkning, utför elektrofores med fem mikroliter förstärkt produkt och späd sedan resten 25 mikroliter av PCR-produkten i autoklaverat ultrarent vatten i förhållandet mellan en och 10. Använd de universella primrar 1062 framåt och 1390 bakåt, utför den andra förstärkningsrundan med 25 cykler. Späd de resulterande PCR-produkterna i autoklaverat ultrarent vatten i lika förhållande.
Utför den tredje förstärkningsomgången med åtta cykler för att märka produkterna med streckkoderna och P1-adaptersekvensen. Kontrollera koncentrationen i kvalitet av PCR-produkter på en bioanalysator och slå samman volymerna som utgör 30 nanogram DNA för varje prov i ett 1,5 ml rör för att förbereda ett ekvimolärt bibliotek. Välj amplikonerna i storlek 350 till 550 baspar efter storleksfraktionering med hjälp av ett automatiserat DNA-storleksvalssystem på en agarosgelkassett.
Samla eluten som innehåller amplikonerna av den angivna storleken i en injektionsflaska i kassetten vilket resulterar i ett renat 16S rRNA-genbibliotek. Överför det uppsamlade elueringsmaterialet till ett 1,5 ml rör och kontrollera renheten och koncentrationen på bioanalysatorn. Späd DNA-biblioteket med autoklaverat ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 26 pikomolärer.
För att förstärka ITS-regionen, efter att ha ställt in reaktionen med ITS-primers, ställ in förstärkningsprofilen på termocyklisten. Analysera sedan fem mikroliter av den förstärkta produkten på 1,5% agarosgel och späd de återstående 25 mikroliterna av produkten i förhållandet mellan en och 10 med autoklaverat ultrarent vatten. Gör PCR-mastermix för det önskade antalet prover med streckkodsmärkta framåtriktade primers och P1-adaptermärkta omvända primers.
Använd den utspädda PCR-produkten som mall, utför den andra förstärkningsomgången. I likhet med biblioteksberedningen för 16S rRNA-genen, förbered biblioteket för den renade ITS-regionen. Initiera bioinformatikanalyserna av EPSPS-proteinsekvensen.
Utvärdera frågesekvensens potentiella känslighet för glyfosat från serverns tillhandahållna utdata där utdata ett visar fraktionen av aminosyramarkörer som finns i frågesekvenserna och antalet motiv. Utdata två visar justeringar av fråge- och referenssekvenserna baserat på markörrester. Utdata tre visar fullständiga parvisa justeringar av fråge- och referenssekvenserna.
Utgång fyra visar EPSPS-referenssekvenser av Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis och Streptomyces davawensis. I slutet av utdatasidan hittar du länkar till externa verktyg som BLASTp och bevarade domäner för att ytterligare analysera EPSPS-frågesekvensen. När du har identifierat EPSPS-sekvenserna från de offentliga förvaren får du åtkomst till dessa datauppsättningar från EPSPS-klassserverns huvudsida som innehåller taxonomisk information och EPSPS-klassen med över 50 000 sekvenser.
Väg växternas biomassa ovan jord i slutet av fältsäsongen för att jämföra växternas tillväxt i GBP och kontrollera tomter. I ett kalkylblad mappar du de bakteriella OTU: erna för mikrobiomexperiment i förberäknade dataset. Och baserat på en probabilistisk poäng, beräkna den inneboende känsligheten för glyfosat.
Denna metod användes för att kvantifiera förändringar i känslighet i EPSPS-proteinet på en mikroevolutionär nivå. Vi identifierade förändringar i känslighetsstatus hos 12 av 32 närstående grupper av prokaryoter som analyserades. Således kan de glyfosatbaserade produkternas kontinuerliga användning producera mikrobiell dysbios i växt-, djur- och jordmikrobiomerna.
Säkerställ kvaliteten på pre- och post-PCR-procedurer för att få optimala amplikonbibliotek. Se också till att EPSPS-proteinsekvensen inte är partiell innan du använder programvaran. Vid fältförsök, se till att förhindra kontaminering av kontroller med glyfosat.