Burada, glifosatın mikrobiyomlar üzerindeki etkisini değerlendirmek için deneyleri yürütmek için en iyi biyoinformatik yöntemini içeren bir iş akışı sunuyoruz. Başlıca avantajı, gelecekteki saha ve laboratuvar deneyleri için sağlam bir test edilebilir hipotez sağlamasıdır. Açıklanan metodoloji, bitkiler, hayvanlar ve mikroplar dahil olmak üzere çeşitli sistemlere uygulanabilir.
Metodolojinin her bir parçası oldukça basittir. Belki de en zor kısım, işin farklı bölümlerini gerçekleştirebilecek multidisipliner bir ekibi entegre etmektir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Suni Matthew olacak.
Başlamak için, deney alanını 10 kontrol kopyasına bölerek ve araziler arasındaki tampon bitki örtüsü şeritleriyle GBP işlemine bölerek birinci deneye başlayın. Tarımsal uygulamalarda izin verilen maksimum glifosat dozajını taklit etmek için kontrol arazilerini musluk suyuyla ve GBP arazilerini ticari GBP ile tedavi edin. Mikrobiyotayı deneysel bitkilerden örnekleyin.
Bitki örneklerinin 10 kopyasını tarladan toplayın, hemen buzun üzerine yerleştirin ve daha fazla işlem için laboratuvara getirin. İkinci deney için, 12 aylık bir kuş kafesi deneyinde odun talaşı, dışkı ve GBP kontamine veya kontrol yemleriyle beslenen bıldırcınlardan dökülen bazı yemler de dahil olmak üzere yatak takımlarını toplayın. Yatak numunelerini, yayıldıktan hemen sonra glifosat konsantrasyon ölçümleri için akredite bir laboratuvara gönderin.
Kök ve yaprak mikrobiyotalarını incelemek için her arsaya çok yıllık çim ve çilek bitkileri ekin. Bitki örneklerini yıkayarak ve sterilize ederek endofitik mikropları tanımlayın ve çıkarın. Numuneler sterilize edildikten sonra, üreticinin protokolünü izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir bitki DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA'yı çıkarın.
İç içe geçmiş bir yaklaşım kullanarak, 16S rRNA geninin V6 ila V8 değişken bölgelerini yükseltin ve metin makalesinde açıklandığı gibi gerekli sayıda örnek için PCR ana karışımını yapın. PCR'nin ilk turu için, 799 ileri ve 1492 geri primerleri kullanın. Termosikletteki amplifikasyon profilini 35 döngü için ayarlayın.
Amplifikasyonu doğrulamak için, beş mikrolitre yükseltilmiş ürün kullanarak elektroforez yapın ve daha sonra PCR ürününün geri kalan 25 mikrolitresini otoklavlanmış ultra saf suda bir ila 10 oranında seyreltin. 1062 ileri ve 1390 geri üniversal primerleri kullanarak, ikinci amplifikasyon turunu 25 döngü ile gerçekleştirin. Elde edilen PCR ürünlerini otoklavlanmış ultra saf suda eşit oranda seyreltin.
Ürünleri barkodlar ve P1 adaptör dizisi ile etiketlemek için sekiz döngü ile üçüncü amplifikasyon turunu gerçekleştirin. Bir biyoanalizör üzerinde PCR ürünlerinin kalitesindeki konsantrasyonu doğrulayın ve bir equimolar kütüphane hazırlamak için her bir numunenin 30 nanogramlık DNA'sını oluşturan hacimleri 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın. Bir agaroz jel kaseti üzerinde otomatik bir DNA boyutu seçim sistemi kullanarak boyut fraksiyonasyonuna göre 350 ila 550 baz çifti boyutlarındaki amplikonları seçin.
Belirtilen boyuttaki amplikonları içeren elute'yi kasetteki bir şişede toplayın ve saflaştırılmış bir 16S rRNA gen kütüphanesi elde edin. Toplanan elüenti 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve biyoanalizör üzerindeki saflığı ve konsantrasyonu doğrulayın. DNA kütüphanesini otoklavlanmış ultra saf su kullanarak 26 pikomolar'lık son konsantrasyona kadar seyreltin.
ITS bölgesini yükseltmek için, reaksiyonu ITS astarlarıyla ayarladıktan sonra, termosiklustaki amplifikasyon profilini ayarlayın. Daha sonra% 1.5 agaroz jeli üzerinde güçlendirilmiş ürünün beş mikrolitresini analiz edin ve otoklavlanmış ultra saf su kullanarak kalan 25 mikrolitre ürünü bir ila 10 oranında seyreltin. Barkod etiketli ileri astarlar ve P1 adaptörü etiketli ters astarlarla gerekli sayıda numune için PCR ana karışımını yapın.
Seyreltilmiş PCR ürününü şablon olarak kullanarak, ikinci amplifikasyon turunu gerçekleştirin. 16S rRNA geni için kütüphane hazırlığına benzer şekilde, saflaştırılmış ITS bölgesi için kütüphaneyi hazırlayın. EPSPS protein dizisinin biyoinformatik analizlerini başlatın.
Sorgu dizisinin, sorgu dizilerinde bulunan amino asit işaretleyicilerinin fraksiyonunu ve motiflerin sayısını gösterdiği sunucudan sağlanan çıktılardan glifosata karşı potansiyel duyarlılığını değerlendirin. İkinci çıktı, sorgunun hizalamalarını ve işaretçi kalıntılarına dayalı başvuru dizilerini gösterir. Üçüncü çıktı, sorgu ve başvuru dizilerinin çift yönlü tam hizalamalarını gösterir.
Dördüncü çıktı, Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis ve Streptomyces davawensis'in EPSPS referans dizilerini göstermektedir. Çıktı sayfasının sonunda, sorgu EPSPS sırasını daha ayrıntılı çözümlemek için BLASTp ve korunmuş etki alanları gibi harici araçların bağlantılarını bulun. Genel depolardan EPSPS dizilerini tanımladıktan sonra, bu veri kümelerine EPSPS sınıfı sunucusunun taksonomik bilgileri ve 50.000'den fazla diziden oluşan EPSPS sınıfını içeren ana sayfasından erişin.
GBP'deki bitkilerin büyümesini karşılaştırmak ve arazileri kontrol etmek için tarla mevsiminin sonunda bitkilerin toprak üstü biyokütlesini tartın. Bir elektronik tabloda, mikrobiyom deneyleri için bakteriyel OTU'ları önceden hesaplanmış veri kümelerine eşleyin. Ve olasılıksal bir skora dayanarak, glifosata karşı içsel duyarlılığı hesaplayın.
Bu yöntem, EPSPS proteinindeki duyarlılıktaki değişiklikleri mikro evrimsel düzeyde ölçmek için kullanıldı. Analiz edilen yakından ilişkili 32 prokaryot grubundan 12'sinde duyarlılık durumundaki değişiklikleri tespit ettik. Bu nedenle, glifosat bazlı ürünlerin sürekli kullanımı, bitki, hayvan ve toprak mikrobiyomlarında mikrobiyoz üretebilir.
Optimum amplikon kütüphaneleri elde etmek için PCR öncesi ve sonrası prosedürlerin kalitesini sağlayın. Ayrıca, yazılımı kullanmadan önce EPSPS protein dizisinin kısmi olmadığından emin olun. Saha deneylerinde, kontrollerin glifosat ile kontaminasyonunu önlediğinizden emin olun.
