Name: economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par le programme du plan scientifique et technologique de Tianjin (20JCQNJC00550), le projet des sciences et technologies de la santé de Tianjin (TJWJ202021QN033 et TJWJ202021QN034).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Nanjing.
1. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM
<ol><li>Sacrifier des souris C57BL/6 (18-22 g, âgées de 6-8 semaines) par asphyxie au CO2 . Réparez la souris sur la table d’opération de la souris. Désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Coupez la peau de la jambe pour expose...

<ol>
	<li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses.">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li><li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo.">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity.">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity.">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells.">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer.">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786 (2021).</li><li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+ontogeny:+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin.">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited:+both+CD8alpha(-)+and+CD8alpha(+)+dendritic+cells+are+generated+from+CD4(low)+lymphoid-committed+precursors.">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions.">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).</li><li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow:+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor.">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li><li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures.">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li><li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells.">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li><li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus.">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li><li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA.">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li><li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate:+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study.">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).</li><li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage.">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li><li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma.">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li></ol>

Les humains et les souris ont des sous-ensembles de DC différents, y compris les DC classiques (cDC, y compris les cDC1 et cDC2), les DC plasmocytoïdes (pDC) et les DC dérivés de monocytes (MoDC)9,10,11. Il est généralement admis que les cDC1 régulent les réponses des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer, et les cDC2 régulent les réponses immunitaires aux agents pathogè...

Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes pour activer les lymphocytes T naïfs et induire des réponses spécifiques aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) contre les maladies infectieuses, les maladies allergiques et les cellules tumorales 1,2,3. Les DC sont le principal lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative et jouent un rôle essentiel dans la défense immunologique et le maintien de la tolérance immunitaire. Au cours des 40 dernières années, de nombreux chercheurs ont cherché à définir les sous-ensembles de DC et leurs fonctions dans l’inflammation et l’immunité. Selon ces études, les DC se développent le long des lignées myéloïdes et lymphoïdes des cellules de la moelle osseuse. Les vaccins tumoraux ont franchi des étapes importantes ces dernières années et ont un avenir prometteur. Mécaniquement, les vaccins tumoraux modulent la réponse immunitaire et empêchent la croissance tumorale en activant les lymphocytes T cytotoxiques à l’aide d’antigènes tumoraux. Le vaccin à base de DC joue un rôle important dans l’immunothérapie tumorale et a été identifié comme l’une des thérapies antitumorales les plus prometteuses 1,4. En outre, les DC ont été largement utilisés dans le test de nouveaux médicaments moléculaires ciblés et d’inhibiteurs du point de contrôle immunitaire5.
Les chercheurs ont un besoin urgent d’un grand nombre de DC de haute pureté pour étudier plus avant le rôle des DC. Cependant, les DC sont rares dans divers tissus et sang, ne représentant que 1% des cellules sanguines chez les humains et les animaux. La culture in vitro de cellules dendritiques de la moelle osseuse (BMDC) est une méthode importante pour obtenir de grandes quantités de cellules DC. Pendant ce temps, le protocole Lutz pour générer des DC à partir de la moelle osseuse a été largement utilisé par les chercheurs6. Bien que le protocole soit efficace pour obtenir des cellules DC, il est complexe et coûteux, impliquant l’ajout de fortes concentrations de cytokines et la lyse des globules rouges.
Dans cette étude, nous rapportons une méthode pour isoler presque toutes les cellules de la moelle osseuse de la moelle osseuse (BM) de souris et induire une différenciation en BMDC après 7-9 jours d’incubation in vitro, avec une concentration plus faible de GM-CSF et d’IL-4. Cette procédure ne prend que 10 minutes pour prélever presque toutes les cellules de la moelle osseuse et les suspendre dans un milieu complet. En bref, nous fournissons une méthode de culture efficace et rentable pour BMDC dans cette recherche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-MHC II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percp/cy5.5-CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRMI-1640</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse GM-CSF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>156603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice

La demande de cellules dendritiques (DC) augmente progressivement à mesure que la recherche en immunologie progresse. Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle d’isolement des DC consiste principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse (BM) dans les DC en injectant de fortes doses (>10 ng / mL) de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages / interleukine-4 (GM-CSF / IL-4), ce qui rend la procédure complexe et coûteuse. Dans ce protocole, en utilisant toutes les cellules BM cultivées dans un milieu GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, après 3-4 échanges de demi-culture, jusqu’à 2,7 x 107 cellules CD11c+ (DC) par souris (deux fémurs) ont été récoltées avec une pureté de 80% à 95%. Après 10 jours en culture, l’expression de CD11c, CD80 et MHC II a augmenté, tandis que le nombre de cellules a diminué. Le nombre de cellules a culminé après 7 jours de culture. De plus, cette méthode n’a pris que 10 minutes pour prélever toutes les cellules de la moelle osseuse, et un nombre élevé de DC ont été obtenus après 1 semaine de culture.

Les cellules 1 x 10 7-1,7 x 107 ont été extraites de deux fémurs et ont été remises en suspension dans 24 mL de milieu avant d’être plantées dans une plaque de 6 puits (Figure 1A). Après 2 jours, les cellules non adhérentes ont été éliminées en changeant complètement le milieu de culture. Avant de changer de milieu, un nombre important de cellules en suspension ont été observées (figure 1B). Après 3 jours de culture, de ...

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Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Protocole économique et efficace d’isolement et de génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris. Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing.One.Introduction. Avec l’augmentation de la recherche sur l’immunité tumorale, la demande de cellules DC augmente progressivement.Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle consistant principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse en DC est compliquée et coûteuse. Deux. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM Nous sacrifions des souris et fixons sur la table d’opération de la souris.Couper la peau des muscles exposés gauches et de l’artère fémorale. Ne coupez pas directement l’artère fémorale. Sinon, il provoquera des saignements abondants et contaminera le champ de vision.Coupez tous les muscles autour du fémur. Étirez lentement les membres inférieurs de la souris vers l’extérieur jusqu’à ce que le prolapsus de la tête fémorale puisse être observé. Séparez les membres inférieurs du corps.Coupez la patte arrière pour obtenir un fémur libre et complet. Retirez les muscles à l’aide de gaze. Ne déchirez pas directement les muscles.Le fémur des souris est fragile. Placez le fémur dans 75% d’alcool pendant deux à cinq minutes. Trois. Culture injectable de BMDC Rincer l’alcool résiduel avec du PBS.Serrez la partie centrale et inférieure du fémur avec une pince hémostatique et serrez l’extrémité inférieure du fémur avec une autre pince hémostatique. Les pinces hémostatiques sont appliquées littéralement sur le fémur et le fémur est brisé de la ligne épiphysaire. Utilisez une seringue d’un ml pour percer la cavité de la moelle osseuse de la ligne épiphysaire.Utilisez un milieu complet en deux parties pour rincer la cavité de la moelle osseuse jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir les liquides de rinçage. Compléter le milieu complet contenant du GM CSF/IL-4 à 24 ml et semer dans une plaque de 6 puits avec 4 ml par puits. Quatre.Résultats.Après deux jours, remplacer tout milieu contenant du GM-CSF/IL-4. La moitié a remplacé le milieu complet contenant du GM-CSF/IL-4, les quatrième, sixième et huitième jours. Le nombre de cellules a atteint un pic le septième jour, puis a diminué progressivement.Les cellules DC ont formé un grand nombre de synapses montrant une morphologie typique des cellules DC matures. Les analyses de la sous-métrique de flux montrent que le ratio de CD11c a imposé ce que 71% le sixième jour, le ratio large augmente à 96,1% le 10ème jour. L’expression de CD11c, CD80 et MSC2 augmentait progressivement avec l’augmentation du temps de culture. Cinq.Conclusion.En bref, nous avons établi un protocole économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris, ce qui ne prend que 10 minutes pour séparer les cellules de la moelle osseuse. Un grand nombre de DC de haute pureté a été récolté après six à sept jours de culture avec 10 ng par ml, GM-CSF et IL-4.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

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